嗜酸乳杆菌GGDEF和EAL结构域相关蛋白的表达、纯化及活性分析

作者：何嘉辉; 孙洁丽; 闫文娟; 王方

来源：南方医科大学学报, 2017, 37(05): 633-639.

DOI：10.3969/j.issn.1673-4254.2017.05.11

• 嗜酸乳杆菌
• 环二鸟苷酸
• GGDEF结构域
• EAL结构域
• 酶活性检测
• 高效液相色谱

目的鉴定嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中含GGDEF和EAL结构域相关蛋白的功能。为进一步研究环二鸟苷酸(c-di-GMP)在该菌株中的调控机制奠定基础。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组中PCR扩增出NH1307045-GGDEF、NH1307050和NH1307055这3个基因片段,分别构建其重组表达质粒。经鉴定后,转入大肠杆菌表达宿主中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经直链淀粉树脂纯化后进行体外酶活性实验,再通过高效液相色谱检测反应产物。结果通过PCR扩增的目的基因片段经重组质粒双酶切后其大小与预期相符,测序结果与Gen Bank中嗜酸乳杆菌ATCC4356基因序列一致,表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western Blot检测表达的重组蛋白相对分子质量分别约为59000(含GGDEF结构域)、67000(含EAL结构域)和72000(含EAL结构域),与预期大小吻合。经树脂亲和柱纯化及浓缩获得目的蛋白。高效液相色谱分析结果显示,NH1307045-GGDEF的表达产物体外无明显双鸟苷酸环化酶(DGC)活性,NH1307050的表达产物体外具有磷酸二酯酶(PDE)活性,而NH1307055的表达产物在体外无明显PDE活性。结论在本研究的3种基因中,NH1307050的表达产物在体外具有磷酸二酯酶(PDE)的活性。为研究环二鸟苷酸在嗜酸乳杆菌中的调控机制提供了实验依据。

• 单位
  南方医科大学; 南方医科大学南方医院; 基础医学院