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摘要
目的 探讨膝痹宁通过肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT1)调节大鼠滑膜氧化还原稳态缓解膝骨关节炎(KOA)疼痛的效应机制。方法 提取大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞(FLS)，采用CCK-8法筛选膝痹宁冻干粉干预FLS细胞的合适作用浓度。将FLS细胞分为对照组、KOA组、膝痹宁组，后两组采用5μg/ml脂多糖(LPS)诱导KOA炎症细胞模型，膝痹宁组加入100μg/ml膝痹宁，培养24 h。采用Real-time PCR和Western blotting检测CPT1、肉碱/有机阳离子转运体1(OCTN1) mRNA和蛋白的表达；采用试剂盒检测CPT1、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；使用2?,7?-二氯荧光素二乙酸酯检测活性氧(ROS)水平。提取大鼠背根神经节(DRG)神经元细胞，采用βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色进行鉴定。将收集的各组FLS上清加入DRG神经元中干预24 h，分别设为对照组、KOA组、膝痹宁组，采用Real-time PCR和Western blotting检测DRG神经元瞬时受体电位A1离子通道(TRPA1)mRNA和蛋白的表达，实时荧光钙成像观察DRG神经元中TRPA1开放后Ca2+内流情况，ELISA法检测降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质(SP)水平。结果 选取膝痹宁冻干粉浓度100μg/ml进行实验。Real-time PCR和Western blotting检测结果显示，膝痹宁组CPT1、OCTN1 mRNA和蛋白表达水平高于KOA组(P<0.05)。与对照组比较，KOA组ROS水平[(26.46±2.07) AU vs.(5.52±0.78) AU]和MDA含量[(3.13±0.02) nmol/ml vs.(2.77±0.03) nmol/ml]明显升高(P<0.05),CPT1[(4.98±0.02) nmol/min vs.(11.50±0.21) nmol/min]和SOD[(11.38±0.05) U/ml vs.(17.6±0.07) U/ml]活性明显降低(P<0.05)；与KOA组比较，膝痹宁组ROS水平[(14.07±1.41) AU]和MDA含量[(2.87±0.01) nmol/ml]明显降低(P<0.05),CPT1[(7.94±0.21) nmol/min]和SOD活性[(13.81±0.07) U/ml]明显升高(P<0.05)。与KOA组比较，膝痹宁组FLS上清干预可抑制DRG神经元中TRPA1 mRNA和蛋白的表达，以及TRPA1开放后Ca2+的内流(P<0.05)，降低CGRP和SP表达量[(19.93±1.2) ng/L vs.(30.19±1.58) ng/L,P<0.05;(84.23±1.26) ng/L vs.(123.16±2.95) ng/L,P<0.05]。结论 膝痹宁可能通过CPT1调控大鼠滑膜细胞氧化还原稳态而影响DRG神经元细胞膜上TRPA1的Ca2+内流，减少疼痛因子的分泌，从而发挥减轻KOA疼痛的作用。
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单位江苏省中医院; 南京中医药大学
