MEK高表达细胞膜层析柱制备及应用

作者：鞠鑫; 许斌; 孟琦雨; 胡翠英; 钱玮; 邵爱华; 郭伟强^*

来源：生物技术, 2019, 29(06): 547-532.

DOI：10.16519/j.cnki.1004-311x.2019.06.0090

• MEK
• 细胞膜
• AZD-6244
• 筛选

[目的]通过制备MEK高表达细胞膜色谱层析柱,建立MEK潜在抑制剂筛选方法和体系。[方法]以非小细胞肺癌细胞系A549为材料,提取总RNA,RT-PCR体外扩增mek基因,随后克隆至p EGFP-C1质粒中,脂质体转染A549细胞,G418筛选,获得稳定转染细胞株,以此稳定转染细胞株为对象,构建MEK+/+的细胞膜层析柱。最后,以MEK抑制剂AZD-6244为受测体,流动相为磷酸盐缓冲液,变性洗脱液为p H 3. 3的磷酸盐缓冲液。所得所有组分采用高效液相检测,检测条件为:Dikma C18柱(150 mm×4. 6 mm,5μm);流动相为甲醇:5 mmol/L磷酸盐缓冲液(60∶40);检测波长为203 nm;柱温为30℃;流速为1. 0 m L/min。[结果]所构建的p EGFP-C1-MEK质粒经酶切、测序鉴定,结果正确; Western Blot检测稳定转染细胞株中MEK蛋白含量较A549细胞大幅提高;高效液相检测表明AZD6244在MEK+的A549细胞膜上有保留,表明所建MEK+A549细胞膜层析柱可应用于MEK抑制剂的筛选和检测。[结论]所构建的MEK高表达细胞膜层析柱具有成为MEK潜在抑制剂筛选的潜在有效方法。

• 单位
  苏州科技大学