NOX4调控神经细胞增殖在神经管缺损发生中的作用

作者：付佳琳; 黄琬淇; 黄天楚; 顾卉^*; 袁正伟

来源：中华小儿外科杂志, 2023, 44(03).

• 神经管缺损
• 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4
• 细胞增殖

目的探究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, NOX4)通过调控细胞增殖对小鼠神经管缺损(neural tube defects, NTDs)形成的作用。方法选用体重18～20 g的健康C57BL/6J小鼠, 雌鼠30只, 雄鼠15只, 雌雄小鼠按2∶1比例于晚上合笼、过夜, 次日清晨观察小鼠阴道栓, 有明显阴道栓确认已交配, 当日记为孕0.5 d(E0.5)。选取明确受孕的18只小鼠, 按随机数字表法随机分为小鼠NTDs组(9只)和对照组(9只)。孕8.5 d(E8.5)时, 将小鼠NTDs组利用全反式维甲酸(all trans retinoid acid, ATRA)按70 mg/kg的浓度灌胃处理, 对照组采用橄榄油灌胃处理。在孕9.5 d(E9.5)收集胎鼠。体式显微镜下观察胚胎神经管发育情况并拍照记录形态。通过免疫荧光染色法观察神经管形态, 蛋白质印迹法(Western blot)检测NOX4和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在神经管的表达情况。构建NOX4过表达质粒(oe-NOX4)和对照(NC)以及NOX4沉默质粒(sh-NOX4 2#、sh-NOX4 3#)和对照(sh-NC), 分别转染至C17.2细胞系中, 通过Western blot检测NOX4及增殖相关蛋白PCNA的表达情况;通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK8)检测转染质粒24 h、48 h、72 h、96 h后细胞生长情况, 进一步明确NOX4对细胞增殖的调控作用。结果体式显微镜下观察E9.5胎鼠神经管发育情况, NTDs组存在明显神经管畸形。免疫荧光染色结果也显示NTDs组存在明显的神经管闭合不全, 对照组神经管发育正常, 且NTDs组神经管中NOX4表达略高于对照组, 而PCNA的表达低于对照组。Western blot结果显示, NTDs组胚胎中NOX4表达(6.24±2.70)高于对照组(1.00±0.51), PCNA的表达(0.75±0.09)低于对照组(1.00±0.12), 两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。在C17.2神经干细胞中转染NOX4过表达质粒(oe-NOX4)和沉默质粒(sh-NOX4 2#、sh-NOX4 3#), 利用Western blot检测NOX4表达水平的变化, 结果显示, 转染oe-NOX4质粒后, NOX4的表达(1.26±0.13)显著高于转染NC组(1.00±0.02), 而转染oe-NOX4质粒后增殖相关蛋白PCNA的表达(0.71±0.10)较NC组(1.00±0.12)显著降低, 差异有统计学意义(P<0.05);相反, 转染sh-NOX4 2#、sh-NOX4 3#质粒后, NOX4的表达为(0.85±0.06)、(0.71±0.06), 显著低于转染sh-NC质粒组(1.00±0.04), PCNA的表达(1.61±0.17)、(1.43±0.17)较sh-NC组(1.00±0.17)明显增加, 差异有统计学意义(P<0.05)。利用CCK8实验探究NOX4对细胞增殖能力的影响, 结果提示, 过表达NOX4, 24 h后与NC组相比, 吸光度为(0.48±0.01)比(0.48±0.02), 48 h为(0.82±0.04)比(1.12±0.03), 72 h为(1.07±0.10)比(2.10±0.10), 96 h为(2.53±0.20)比(3.01±0.43), 细胞增殖能力呈下降趋势, 差异有统计学意义(P<0.05);而与sh-NC相比, 当转染sh-NOX4 2#、sh-NOX4 3#, 24 h吸光度分别为(0.32±0.02)、(0.31±0.02)、(0.30±0.01), 48 h为(0.77±0.02)、(0.64±0.04)、(0.37±0.04), 72 h为(1.94±0.05)、( 1.69±0.03)、(1.24±0.08), 96 h为(2.33±0.11)、( 2.11±0.05)、(2.01±0.01), 细胞增殖能力有显著提高, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NTDs中异常高表达的NOX4能够通过降低增殖相关蛋白PCNA的表达, 抑制细胞增殖, 导致小鼠神经管闭合异常。

• 单位
  中国医科大学附属盛京医院