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摘要
目的:构建靶向约200个AML基因突变的sg RNA基因敲除文库,为进一步探索诱发AML的信号通路网络奠定基础。方法:TCGA对200名AML病人进行了全基因组或全外显子组测序,鉴定出约2000个AML相关基因突变,从中选出了约200个突变两次或以上的基因作为靶向基因;接着,从Brie文库中挑选出相应基因的sg RNA序列,每个基因对应4条sg RNA;利用Gibson组装酶连接到慢病毒载体内,得到sg RNA文库;之后,采用pSSA荧光素酶基因报告系统鉴定文库sg RNA的切割活性;对文库进行高通量测序鉴定;用慢病毒包装文库,并测定病毒滴度。结果:1、构建了一个靶向约200个AML突变的sg RNA基因敲除文库;2、pSSA荧光素酶基因报告系统鉴定文库sg RNA具有切割活性;3、鉴定的7个单克隆质粒序列完全正确;4、高通量测序鉴定文库丰度和均一性符合要求;5、用慢病毒包装成病毒文库,测定病毒文库滴度为4.4×107符合后续实验要求。结论:成功构建了靶向约200个基因突变的sg RNA敲除文库,可用于大规模地筛选诱发AML的基因突变,为探索AML发生、发展的分子机制以及药物靶点奠定基础。
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