针对非洲猪瘟病毒p30基因CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建和初步鉴定

作者：于海男; 崔帅; 王洋; 刘雪婷; 高新桃; 房立春; 郭晓宇; 朱鸿飞^*

来源：中国动物传染病学报, 2023, 31(02): 59-66.

DOI：10.19958/j.cnki.cn31-2031/s.2023.02.001

• 非洲猪瘟病毒
• p30基因
• CRISPR/Cas9
• 单导向RNA
• 真核表达

构建针对非洲猪瘟病毒（ASFV）p30(CP204L)基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，探究该系统对p30蛋白真核表达的影响。以含p30基因序列的质粒p30-IRES为模板，定向扩增目的基因片段并克隆至pmCherry-N1载体，构建含有p30、红色荧光报告基因的融合表达质粒；通过网站http://crispr.mit.edu/设计靶向CP204L的单导向RNA(sgRNA)，并克隆至Cas9表达质粒eSpCas9-2A-GFP(PX458)中。将融合表达质粒与Cas9表达质粒共转染HEK 293T细胞，同时设置对照组，转染48 h后通过Westernblot和荧光定量PCR(qPCR)方法分别检测转染细胞中p30蛋白和mRNA表达水平。由于CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向切割p30基因，Western blot和qPCR结果显示转染靶向p30基因的Cas9质粒后，p30蛋白的真核表达受到抑制，具有显著性差异（P<0.05）。结果表明，CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效切割非洲猪瘟p30基因，抑制该蛋白的真核表达水平，该体系为抑制病毒生长和疫情防控提供了新的研究思路。

• 单位
  山东省农业科学院; 中国农业科学院生物技术研究所; 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所