人γ干扰素转座子质粒构建及其在HEK293T细胞中的表达

作者：陈秋玉; 徐闰; 刘灵康; 韦茏芹; 吴文德; 郑喜邦^*; 李恭贺^*

来源：生物技术, 2021, 31(06): 521-572.

DOI：10.16519/j.cnki.1004-311x.2021.06.0080

• 人γ干扰素
• 重叠延伸PCR
• 自剪切肽P2A
• PiggyBac转座子
• HEK 293T细胞

[目的]克隆人γ干扰素(hIFNγ)基因，借助自剪切肽P2A,构建hIFNγ-P2A-RFP(红色荧光蛋白)融合基因转座子表达载体，并在HEK293T细胞中检测其表达水平。[方法]首先，以脂多糖(LPS)激活人外周血淋巴细胞，提取总RNA,经RT-PCR扩增hIFNγ基因；再通过重叠延伸PCR,获得hIFNγ-P2A-RFP融合基因，并将其插入PB002G转座子载体。经双酶切和DNA测序鉴定，将重组质粒转染HEK 293T细胞，荧光显微镜观察RFP表达，Western Blotting检测hIFNγ蛋白表达。[结果]克隆了hIFNγ基因，成功构建了PB-hIFNγ-P2A-RFP重组质粒；荧光显微镜观察发现RFP在HEK 293T细胞表达，转染效率达39.3%;Western Blotting检测显示，特异性蛋白条带约为21 kDa,与预期的hIFNγ蛋白大小一致。[结论]成功构建了人γ干扰素PB转座子真核表达质粒，该质粒在HEK 293T细胞中高效表达。

• 单位
  广西大学; 湖北天勤生物科技有限公司