构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

作者：梅芬; 李瑞玮; 张娟娟; 左荣霞; 邹云莲; 沈涛; 撒亚莲^*

来源：生物技术通报, 2020, 36(03): 110-114.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0270

• ALOX5
• CRISPR/Cas9
• 基因敲除
• 构建
• 质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5 基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5 基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。

• 单位
  华中科技大学同济医学院; 昆明理工大学; 云南省第一人民医院; 云南省第三人民医院