构建与鉴定人源ITPKB基因腺病毒载体

作者：傅海寿; 蔡鹏威^*

来源：医学理论与实践, 2020, 33(12): 1899-1924.

DOI：10.19381/j.issn.1001-7585.2020.12.003

• ITPKB
• 腺病毒
• HEK293细胞

目的:构建并制备人源ITPKB基因重组腺病毒(pADM-ITPKB-FLAG-GFP)感染HEK293细胞,为局麻药毒性的研究奠定基础。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增全基因合成人源ITPKB基因,与pAdM-FH-GFP载体在DH5α感受态细胞进行转化,形成pADM-ITPKB-FLAG-GFP。将重组后腺病毒质粒转染入HEK293细胞,并在HEK293细胞内经过包装、扩增、收集、浓缩,收集浓缩病毒并测定病毒滴度。人源腺病毒感染HEK293细胞,设置为ADM-ITPKB组,阴性腺病毒感染HEK293细胞,设置为ADM-FH-GFP组,用PCR鉴定HEK293细胞mRNA表达量差别。结果:PCR鉴定及核酸测序表明pADM-ITPKB-FLAG-GFP成功构建;病毒终点稀释实验收集到的腺病毒浓度为5×1010PFU/ml;PCR鉴定HEK293细胞ITPKB的mRNA表达水平为阴性对照组的22 851.6倍。结论:人源ITPKB基因腺病毒载体构建成功,可为ITPKB基因应用于局麻药中奠定基础。