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摘要
【目的】在黑曲霉(A.niger)中重组表达灵芝L菌漆酶基因，并对其发酵条件进行优化，旨在获得一株高产灵芝漆酶的黑曲霉基因工程菌。【方法】从灵芝L菌克隆漆酶基因Lac-L,并根据黑曲霉密码子偏好性进行优化。选用黑曲霉糖化酶启动子(PglaA)、信号肽及终止子为表达原件，以米曲霉pyrG基因为筛选标记，构建漆酶表达盒，采用聚乙二醇-CaCl2法将其转化至黑曲霉X1 (ΔpyrG)原生质体中。对转化子进行PCR验证及固态发酵酶活测定，筛选高产漆酶重组菌株，并对阳性转化子固态发酵培养基碳源、无机与有机氮源比例、Cu2+浓度及发酵时间进行优化。【结果】经尿嘧啶缺陷及含2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt),ABTS)培养基筛选获得25株重组漆酶转化子，酶活复筛获得灵芝漆酶异源表达6号重组菌株，发酵72 h酶活可达3 532.6 U/kg,宿主菌株的酶活仅为58.37 U/kg。重组6号菌优化后的最适固态发酵条件为：以麸皮为基础培养基，添加2%麦芽糖、2%(NH4)2SO4、0.25 g/L CuSO4,发酵60 h时重组菌株产漆酶活力最高，达到6 255.47 U/kg。【结论】在黑曲霉中成功实现灵芝L菌漆酶基因Lac-L的异源表达。
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