基于定向进化技术提高呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性

作者：李越; 池慧兵; 牛家峰; 马斌; 周慧敏; 朱萍; 吕凤霞^*

来源：南京农业大学学报, 2023, 1-13.

• 呕吐毒素解毒酶
• 定向进化
• 催化活性
• 分子动力学模拟

[目的]呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)C3位羟基的异构化是生物脱毒的关键部位，其中DepA作为DON生物转化中第一步关键限速酶，存在催化活性低的问题，限制了其在食品及饲料加工领域中的应用。本文旨在通过定向进化技术对DepA进行分子改造，以期获得催化活性显著提高的突变酶，提高其工业化应用的潜力。[方法]通过易错PCR和DNA shuffling相结合的方法，构建突变文库，经高通量筛选后，对催化活性明显提高的突变体进行酶学性质表征。同时，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，探究突变酶催化活性提高的分子机制。[结果]成功筛选到突变酶S2、S10和S12，与野生型相比，比活力分别提高了207%、293%和268%。动力学参数结果显示，突变酶S2、S10和S12的Km值分别为56.89、27.00和40.65 μmol·L-1，是野生型的91.7%、43.5%和65.5%，kcat/Km值分别为327.30、576.67和380.07 L·mmol-1·s-1，是野生型的1.25、2.20和1.45倍，相比野生型，突变酶亲和力和催化效率均显著提高。此外，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，发现柔性增加、底物DON的进攻距离缩短、氢键增加、疏水性增加和远端效应是导致其催化活性提高的主要原因。[结论]本研究通过易错PCR和DNA shuffling相结合的定向进化策略有效提高了呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性，为其工业化应用提供依据。

• 单位
  南京农业大学