野生型p27和核定位信号缺失型p27真核表达载体的构建及表达

作者：焦鑫艳; 张英; 盛秋; 张妙; 杨泽健; 高小倩; 赵谦; 王博^*; 刘培军

来源：西安交通大学学报（医学版）, 2022, 43(04): 516-521.

• p27
• CDKN1B
• 核定位信号序列
• 真核表达

目的 构建人野生型p27(p27WT)和核定位信号缺失型p27(p27△NLS)的真核表达载体，并在HEK293T细胞中进行表达，为细胞中p27核浆定位的变化及其不同的生物学功能研究提供细胞基础。方法 提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA，反转录cDNA后，分别进行p27全长和非NLS区片段的PCR扩增，获得p27WT全长(CDKN1B,NM＿004064.5)和p27△NLS编码区序列，分别将其克隆至真核表达载体pCMV-Blank，经菌液PCR、双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染HEK293T细胞，48 h时分别提取胞核蛋白和胞质蛋白，Western blotting检测p27在细胞质和细胞核中的蛋白表达。结果测序结果显示，真核表达载体pCMV-Blank中插入的p27WT序列和p27△NLS序列均与NM＿004064.5序列相一致。pCMV-p27WT转染HEK293T细胞后，细胞总p27蛋白表达显著增加，核浆分离检测发现其在细胞质和细胞核中均表达；而pCMV-p27△NLS转染HEK293T细胞的总p27蛋白表达也显著增加，核浆分离检测发现其主要在细胞质中表达。结论 成功构建人p27WT和p27△NLS的真核表达载体，并在HEK293T细胞中成功表达，为p27蛋白在肿瘤细胞周期中的功能研究提供了细胞基础。

• 单位
  西北工业大学; 西安交通大学第一附属医院