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摘要
中药鉴定是中医药研究的重大课题,其宗旨是为了解决中药材“真伪优劣”的问题,而传统的中药鉴定方法如性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等由于存在主观性强、稳定性和重复性差等方面的缺陷。DNA条形码作为可用于中药分子鉴定的新技术,可以迅速、准确鉴定物种,待测样品只需经过DNA提取、PCR扩增、电泳检测、基因测序和数据库比对,便可确定物种,能方便地将混品、伪品和正品进行区分,因而DNA条形码技术得到中药鉴定工作者越来越广泛的关注。而目前关于DNA条形码应用于中药鉴定的研究存在两方面的局限性：1)均未阐明作为研究对象的药材基原与混伪品或非药用的近缘种的物种间是否进化完全,即互为单系,这是药材分子鉴定的前提,在此基础上进行药用植物和药材的分子鉴别才有客观全面的分子尺度。2)多采用原植物新鲜叶片为研究对象,而不是实际应用中的饮片和药材,DNA条形码技术能否克服药材材料的特殊性和DNA经炮制加工后降解和断裂等问题,还值得尝试和验证。本研究选取药用资源极其丰富的当归属(Angelica L.)植物及药典记载药材白芷、当归和独活为研究对象,基于分子系统学理论,利用DNA条形码技术,选取叶绿体trnH-psbA、 matK、 rbcL片段和核基因ITS,进行DNA提取、PCR扩增和测序,基于K2P模型采用邻接法(NJ)建立系统进化树,以期达到以下研究目的：①筛选出当归属植物DNA条形码研究最合适的片段：②评价DNA条形码对当归属(药用)植物鉴别能力；③探讨DNA条形码对药材市场上当归和独活饮片混用及掺伪问题的解决能力；④研究白芷药材加工炮制过程对成功进行分子鉴别的影响；⑤阐明DNA条形码对白芷4个商品品种(川、杭、祁、禹)进行产地鉴别的可能性；⑥初步探讨中药白芷的栽培起源问题。得到结果如下：1.筛选出ITS为当归属植物DNA条形码研究最合适的片段。共得到当归属25种(含4个亚种)原植物的384条序列,其中ITS96条,trnH-psbA96条,matK96条,rbcL96条。所选4个片段的DNA提取、PCR扩增和测序的成功率均为100%,可见在通用性上无差别,但在物种鉴定上,ITS明显优于其余三个片段。四个片段的种间遗传距离均大于种内遗传距离,且从大到小依次为ITS>trnH-psbA>matK>rbcL。其中,ITS序列种间遗传距离为种内遗传距离的50倍之多,种间/种内遗传距离界限明显,可以很好地用于物种间鉴定。在所构建的以支持率≥50%为阈值作为成功鉴别物种界限的NJ中,ITS能从25种当归属原植物中成功鉴别出19种(76%),而其余三个片段对当归属25种植物的鉴别能力分别为trnH-psbA8种(32%)、matK11种(44%)、rbcL5种(20%)。因此,本研究推荐ITS为当归属植物DNA条形码的标准片段。2.DNA条形码对当归属16种药用植物能够进行有效鉴别。本实验的25种原植物中,有19种可做药用。在基于当归属研究最适宜的条形码片段ITS序列建立的NJ树中,19种药用植物中除了疏叶当归(Alaxifoliata)、紫花前胡(A. decursiva)和骨缘当归(A. cartilaginomarginata var. foliata)无法分开外,其余16种药用植物均能很好地和其他各种区分开,当归属药典记载药材白芷、独活和当归分别位于NJ树的上中下三部分,各自进化为单系,可作为可靠的鉴别依据进行药材质量控制和真伪鉴定。3.DNA条形码能成功应用于当归和独活饮片鉴别。基于上述原植物ITS序列建立的NJ树中当归和独活原植物均为单系(支持率100%),因此可以进行分子鉴定。选取全国10个地区的当归饮片共59个样品,独活饮片共58个样品参与实验,得到92条ITS序列,trnH-psbA103条序列,matK89条序列,rbcL103条序列,PCR成功率／测序成功率为ITS(92.3%/85.2%)、 trnH-psbA(96.6%/91.2%)、 matK(88.9%/85.6%)、rbcL(92.3%/95.4%)。4个片段在当归和独活饮片中均能以较高成功率进行PCR扩增和测序,DNA条形码在当归和独活饮片鉴别中具有技术上的可行性。采用NJ法将25种原植物与当归、独活饮片的ITS序列一起构建系统进化树。结果表明,在当归饮片中,来自9个地区(北京、河津、成都、长沙、淄博、武汉、滨州、周口、七台河)的全部当归饮片和来自德州的GDZ-1都与当归原植物(A. sinensis)聚为一支,均为当归正品；而来自德州的样品GDZ-2、 GDZ-4、 GDZ-5、 GDZ-7、 GDZ-8虽与当归原植物聚为一大支,但又独自聚为一小支,其与当归原植物相差约40个碱基,在Genbank上进行BLAST,与欧当归(Leristicum officimale)序列完全一致,推测其为欧当归(市售当归饮片常见伪品之一)。在独活饮片中,来自8个地区(北京、河津、成都、长沙、淄博、武汉、周口、七台河)的全部独活饮片和来自滨州的HBZ-1均与独活原植物重齿毛当归(A. biserrata)序列聚为一支,为独活正品；来自滨州的样品HBZ-4、 HBZ-6和德州的HDZ-4、 HDZ-6、 HDZ-8与上述当归伪品欧当归序列完全一致,聚为一支,推测这些样品也为欧当归(欧当归在市场上也作独活饮片的伪品)。为进一步验证DNA条形码鉴定的准确性,又对上述分子鉴定为欧当归的样品进行显微鉴定,发现其与正品当归和独活显微结构有较大差异,经查阅文献,与欧当归显微结构相似,显微鉴定结果与DNA条形码分子鉴定的结果一致。4.DNA条形码对白芷不同加工程度药材分子鉴定的探讨本研究同样选取来自上述10个地区的白芷饮片共60个样品,以及白芷药材4个品种的传统产区遂宁、合肥、安国、禹州的生药材(“个子货”)共14个样品。得到白芷饮片ITS序列7条、trnH-psbA序列15条、rbcL序列29条和matK序列10条,PCR成功率/测序成功率分别为：ITS(46.7%/25.0%)、trnH-psbA (40.0%/62.5%)、 rbcL (51.7%/93.5%)、 matK (30.0%/55.6%);得到白芷生药材ITS序列12条,trnH-psbA序列11条、rbcL序列12条和matK序列12条,PCR成功率/测序成功率分别为ITS(100%/85.7%)、 trnH-psbA (85.7%/91.7%)、 rbcL (92.9%/92.3%)、 matK (100%/85.7%),可以看出白芷药材4个片段PCR成功率显著高于白芷饮片,两者测序成功率除rbcL相差不大外,其余三个片段白芷药材均高于白芷饮片,可能是白芷饮片经加工炮制后,淀粉多而粉性大,提取的DNA质量差、杂质多的缘故。因此,某些药材的加工过程对成功进行分子鉴别是有影响的,针对特殊材料况如何改进方法、提高该技术应用的通用性,建立起DNA条形码用于药材分子鉴定的标准化体系,将是药材分子鉴定技术又一个质的飞跃。5.DNA条形码应用于白芷的产地鉴别能力有限为了对白芷四个商品品种进行产地鉴别,在白芷药材4个品种的传统产区遂宁(川白芷)、合肥(杭白芷)、安国(祁白芷)、禹州(禹白芷)各选取2-4个白芷药材根(“个子货”),得到ITS序列12条,trnH-psbA11条,matK12条,rbcL12条。将所得四个片段的序列分别比对后发现,各片段4个产地的白芷药材序列完全一致,无法鉴别开来,表明DNA条形码对白芷产地鉴别是无效的。药材产地鉴别的实质是生物学种下居群水平的遗传分化问题,可以依据群体遗传学和分子谱系地理学的理论,选用相对于物种水平具有更快进化速率的DNA片段,分析其遗传分化程度,来寻找作为药材产地鉴别的分子地理标识。6.DNA条形码对白芷栽培起源的研究选取白芷药材4个品种共14个个体,得到川白芷ITS序列2条、杭白芷和禹白芷各3条、祁白芷4条,将所得共12条ITS序列与当归属原植物ITS序列共同构建NJ树,得到4个品种均与兴安白芷(A. dahurica)亲缘关系最近,与之前一些学者认为的白芷栽培起源于台湾白芷(A.dahurica var.formosana)的观点不一致。因此,对白芷的栽培起源问题需要进一步进行分子谱系地理学的深入研究。基于上述实验结果,本研究结论如下：①ITS是对当归属(药用)植物分子鉴别最适合的片段；②利用当归属DNA条形码研究最适合的片段ITS可以准确鉴别当归与独活饮片的混伪品。③有些药材的加工炮制过程对成功进行分子鉴定是有影响的(如本研究中白芷生药材到饮片的加工过程使分子鉴定的成功率显著下降)。④DNA条形码对白芷产地鉴别是无效的。⑤本研究白芷4个品种均与兴安白芷亲缘关系最近,与之前学者认为的白芷栽培起源于台湾白芷的观点不一致,需要进一步进行分子谱系地理学的深入研究。本研究的创新性为：首次建立了DNA条形码用于药材鉴定的科学方法和指导原则,即DNA条形码用于药材鉴定的“两步法”：一、基于分子系统学理论,利用所需鉴别药材所在的属最适合的DNA条形码片段构建系统进化树,确定所要鉴别药材原植物物种在整个属中系统位置的单系性。二、在物种分子界限得以明确之后,再利用DNA条形码对药材进行鉴定,对于存疑药材,可以根据其位于该属植物中的系统进化地位,对其混淆和替代现象提供科学的阐释和鉴定依据。
