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摘要
【目的】通过对猪(Sus Scrofa)金属硫蛋白1A(metallothionein-1A of S. Scrofa, SsMT-1A)和2A(Metallothionein-2A of S. Scrofa, SsMT-2A)的生物信息学分析、原核表达和纯化，研究它们与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。为饲料中添加Zn和Cu在促进猪生产性能的作用机制研究提供理论基础。【方法】首先，从NCBI中获得SsMT-1A和SsMT-2A的基因序列，利用ClustalX2和ExPASy分析两者的蛋白序列和结构差异，利用MEGA-X构建两者与其他物种MT蛋白分子的进化树。其次，构建pET-28a-SUMO-SsMT-1A/SsMT-2A原核表达载体，转化BL21(DE3)plysS，用IPTG诱导表达。利用Ni-NTA柱亲和层析和葡聚糖凝胶层析纯化重组蛋白。最后，利用大肠杆菌金属耐受性实验、圆二色光谱（circular dichroism, CD）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser analytic ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）和等温微量热仪（isothermal micrometer calorimetry, ITC）分析SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。【结果】生物信息学分析表明：SsMT-1A和SsMT-2A蛋白分子的同源性较高，半胱氨酸（Cysteine, Cys）含量和排列基序完全一致，仅有8个非Cys位点差异。经原核表达、Ni-NTA柱和Superdex-75柱纯化、SUMO酶酶切，成功获得了SsMT-1A和SsMT-2A。金属耐受性试验表明：与SsMT-2A相比，转SsMT-1A大肠杆菌具有较强的Zn和Cu耐受性。CD光谱表明：SsMT-1A和SsMT-2A均可与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合，两者均展示了Zn(Ⅱ)结合偏好性，然而，SsMT-1A较SsMT-2A具有较强的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合能力。MALDI-TOF-MS表明：apo-SsMT-1A和apo-SsMT-2A的分子量分别为6 047.5 Da和6 048 Da,SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合稳定，与Cu(Ⅰ)的结合不稳定。ITC表明：SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合不稳定，与Cu(Ⅰ)的结合稳定，两者结合Cu(Ⅰ)的化学计量数均为7,SsMT-1A结合Zn(Ⅱ)的化学计量数为2。【结论】虽然SsMT-1A和SsMT-2A具有较高的同源性，然而，8个非Cys位点的差异决定了两者金属结合特性的差别。尽管SsMT-1A和SsMT-2A共享了高度一致的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合行为，然而，两者与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性存在细微差别，两者不应被认为是完全生理等价分子。在生理条件下：SsMT-1A可能发挥重金属离子的解毒作用，SsMT-2A可能发挥Zn内稳态的调控作用。本研究为进一步阐明SsMT-1A和SsMT-2A调节金属离子内稳态，发挥促进猪生产性能的作用研究奠定了基础。
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