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摘要
旨在构建1羟化酶(CYP27C1)真核表达载体，在293T细胞中重组表达CYP27C1-mycHis,探究cyp27c1基因在成年鸡不同组织中的表达水平，明确1α-羟化酶三级结构特征、与底物识别和活性中心底物结合相关的关键氨基酸。将合成的cyp27c1的开放阅读框(ORF)插入pMD18-T质粒，并将该质粒命名为pMD-cyp27c1。以改造后的质粒为模板，通过PCR扩增cyp27c1 ORF,将其插入pcDNATM3.1,构建真核表达载体pcDNA-cyp27c1。然后分别用pcDNA-cyp27c1及空载体pcDNA瞬时转染293T细胞，48 h后收集细胞，提取线粒体，用Bradford法测定蛋白质的质量浓度。1μg线粒体用于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，以myc抗体作为一抗检测重组CYP27C1在293T细胞中的表达水平。利用实时荧光定量PCR检测cyp27c1在成年鸡组织中的表达水平。通过生物信息学分析CYP27C1的理化特性，并预测其亚细胞定位，利用同源建模、多序列同源比对和分子对接法研究CYP27C1的空间结构特征以及与底物(25-OH D3)结合和识别相关的关键氨基酸。测序结果显示，1 608 bp编码区插入到pcDNATM3.1,并成功在其3′端融合了载体表达标签myc-His。在重组表达CYP27C1-mycHis的293T细胞线粒体中检测到相对分子质量为58 000的特异性条带。实时荧光定量PCR结果表明，cyp27c1基因在鸡肝、肾、胸肌、腿肌、小肠、胸腺、脾、肾上腺、睾丸、卵巢等组织中均有表达，并且相对表达量存在组织差异性。cyp27c1基因编码1个由536个氨基酸组成的细胞色素P450,亚细胞定位于线粒体上，成熟蛋白质N-末端起始于V62。同源建模结果显示，CYP27C1中α螺旋、β折叠的氨基酸数量分别占蛋白质中总氨基酸数量的49.15%、5.90%,具有与其他线粒体细胞色素P450相似的开放式三级结构。多序列比对和分子对接结果表明，C482、R135与血红素形成较强的氢键；A136、K83是与25-OH D3识别的关键氨基酸；活性中心L343、D347是与25-OH D3结合的关键氨基酸。本研究成功构建了CYP27C1真核表达载体，并在293T细胞中超表达CYP27C1,确定了CYP27C1的三级结构和与底物识别及结合相关的关键氨基酸，为后续深入研究CYP27C1结构、功能和催化机制提供了基础。
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单位陕西理工大学; 汉中市中心医院
