基于CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞

作者：陈华木; 孙良忠^*; 胡妙月; 林宏容; 王海燕; 钟静琳; 吴小红

来源：山东医药, 2020, 60(17): 21-115.

• 肾单位肾痨
• NPHP1基因
• CRISPR/Cas9技术
• 基因敲除

目的利用CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞,为肾单位肾痨(NPHP)发病机制的研究提供体外细胞模型。方法针对犬NPHP1第5外显子区域设计3对引导RNA序列(sgRNA),构建重组真核表达载体PX459-sgRNA;以脂质体Lipo2000转染犬肾集合管上皮细胞MDCK,嘌呤霉素筛选成功转染细胞。基因测序和脱靶检测以验证敲除位点,分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测敲除靶基因的mRNA和蛋白,显微镜下观察细胞形态变化。以慢病毒转染shRNA敲低NPHP1基因表达的MDCK细胞为对照,同法检测敲低靶基因的蛋白,并观察细胞形态。结果 3对sgRNA通过重组真核表达载体,成功转染MDCK细胞。筛选获得1株NPHP1稳定敲除的MDCK细胞,基因测序显示为小片段缺失与移码点突变的复合杂合突变[c. 500551del(p. His167GlnfsTer14)和c.499delC (p. His167ThrfsTer31)]。基因测序显示,8个可能脱靶位点与原位点测序一致,排除脱靶情况。CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的MDCK细胞NPHP1 mRNA表达下降,NPHP1基因编码蛋白nephrocystin-1表达完全缺失; shRNA技术构建NPHP1基因敲低的MDCK细胞nephrocystin-1表达减低。MDCK细胞聚集分布,呈铺路石样改变;两种技术构建的MDCK细胞外形改变类似,略呈长梭形,细胞间隙稍增大。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建了NPHP1基因稳定敲除的MDCK细胞,将有利于NPHP发病机制的体外研究。

• 单位
  中山大学孙逸仙纪念医院; 中山大学附属第一医院; 南方医科大学南方医院