FoxO1抑制剂细胞筛选模型的构建与应用

作者：杨梦夏; 张晋; 杜郁; 何维; 王雪蕾; 王丽^*; 洪斌^*

来源：中国医药生物技术, 2019, 14(03): 199-209.

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2019.03.002

• FoxO1
• 糖脂代谢
• 双报告基因
• 细胞模型
• 高通量筛选分析

目的构建含有人叉头框蛋白O1(Fox O1)结合靶位点(即胰岛素反应元件,IRE)的以萤火虫荧光素酶(Luc2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为双报告基因的Fox O1抑制剂高通量筛选细胞模型,进行Fox O1抑制剂的筛选,并对获得的阳性化合物细胞活性进行初步研究,以期获得能够调节糖脂代谢紊乱相关疾病的先导化合物或候选药物。方法用分子生物学的方法,构建含有胰岛素反应元件的并连接Luc2和EGFP双报告基因的重组载体pc-IRE-LE。将体外培养的HEK293T细胞用该重组载体进行瞬时转染,分别利用萤火虫荧光素酶试剂盒和荧光显微镜对荧光素酶活性及绿色荧光蛋白表达进行检测,从而构建细胞模型并对其进行进一步优化和评价。应用该细胞模型对化合物库进行高通量筛选,随后利用实时定量RT-PCR的方法对筛选获得的阳性化合物的Fox O1抑制剂活性,即对Fox O1多个糖脂代谢相关靶基因m RNA表达进行检测。结果成功构建了具有Luc2和EGFP双报告基因的Fox O1抑制剂高通量筛选细胞模型,并完成了模型评价。经过对6000余个化合物的筛选,共获得6个具有明显的剂量-效应关系的阳性化合物。其中化合物7625-H9在模型上表现出良好的Fox O1抑制剂活性,并在细胞上对Fox O1多个靶基因PEPCK、G6Pase、apoC-III和MTP的m RNA水平均有显著的抑制作用。结论该模型符合高通量筛选的要求,可用于Fox O1抑制剂的高通量筛选。该模型的应用将为新型调节糖脂代谢紊乱药物的发现提供一个可靠而有效的方法。

• 单位
  中国医学科学院医药生物技术研究所