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摘要
为探究鸭疫里默氏杆菌(RA) IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87＿05150的功能，本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150，经PCR及测序鉴定，结果显示AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150和回补株cYb2Δ5150均正确构建，缺失株的表型为16S r RNA+AS87＿05150 ORF-，回补株的表型为16S r RNA+AS87＿05150 ORF+。采用荧光定量PCR (qPCR)检测Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株AS87＿05150基因的转录水平；根据上述3株菌不同时间的OD600nm值绘制各菌株的生长曲线；采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力；将107 cfu/孔的Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株分别感染Vero细胞，检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。q PCR检测结果显示，cYb2Δ5150株中AS87＿05150 m RNA相对转录水平比Yb2株高约19倍(P<0.0001),Yb2Δ5150株未扩增到AS87＿05150基因；生长曲线结果显示，Yb2Δ5150与Yb2株的生长曲线基本一致，但cYb2Δ5150生长速度与Yb2Δ5150株相比极显著下降(P<0.01);BF测定结果显示，Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株BF的形成能力与Yb2株相比均极显著降低(P<0.0001)；黏附和侵袭力结果显示，这3株菌对Vero细胞的黏附和侵袭力均无显著差异。将3株菌分别以108 cfu/只～104 cfu/只、1010 cfu/只～106 cfu/只和109 cfu/只～105 cfu/只的剂量经肌肉注射接种雏鸭，感染后观察雏鸭的发病情况，并采用Reed-Muench法计算3株菌对雏鸭的半数致死量(LD50)；将3株菌均以107 cfu/只经肌肉注射感染雏鸭，24 h后剖杀，无菌采集各组鸭血液、肝脏和脑组织，作相应处理后涂板采用平板计数法测定载菌量。根据各组鸭的死亡情况，计算Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株的LD50分别为6.85×105 cfu、8.75×107 cfu和4.681×108 cfu，即缺失株LD50比野生株高约127倍，但回补株的LD50比缺失株高约5倍。载菌量测定结果显示，Yb2Δ5150株和cYb2Δ5150株感染鸭血液、肝脏、脑组织中的细菌载量比Yb2株感染鸭的载菌量均极显著降低(P<0.001)，但前两者之间上述指标均无显著差异。本实验结果表明AS87＿05150与RA Yb2株的BF形成和致病性相关，但回补株对雏鸭的毒力和致病性均未回复到野生株的水平。本研究为进一步解析RA AS87＿05150的功能及分子致病机制等奠定了基础。
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