抗布鲁氏杆菌Ⅳ型分泌系统表面蛋白VirB12纳米抗体的制备

作者：熊婧璠; 谢媛; 张鑫; 王飞; 陈媛媛; 李江伟^*

来源：国际生物医学工程杂志, 2022, 45(04).

• 布鲁氏杆菌
• VirB12
• 纳米抗体
• 噬菌体展示文库
• 热稳定性

目的制备能与VirB12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体, 为后续研究奠定基础。方法采用VirB12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼, 从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA, 通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆, ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与VirB12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列, 最后得到个5非冗余序列, 分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株, 在16 ℃下进行胞间质可溶性表达, 经Ni亲和柱纯化表达后, Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与VirB12抗原的结合能力与热稳定性。结果经VirB12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24 000。从VirB12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×108 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明, 5株抗VirB12纳米抗体质量分数接近90%, 且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性;4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性, 在90 ℃处理后, 仍能保留60%以上的结合活性。结论通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗VirB12纳米抗体, 为VirB12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。