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摘要
旨在构建泛素结合酶USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,并在细胞中检测该基因的抑制表达水平,以期寻找Uba6-USE1特异性泛素化通路对应的下游底物并研究其功能。选取并合成靶向USE1基因的特异性shRNA序列,将其克隆至pLL3.7慢病毒抑制表达载体上,构建抑制USE1基因表达的重组慢病毒质粒并鉴定。将鉴定成功的重组质粒与psPAX2、VSVG慢病毒包装载体共转染至HEK-293细胞,收集病毒上清,测定病毒滴度并确定最佳感染稀释倍数,通过qPCR和Western Blot方法检测病毒感染HEK-293细胞后对USE1基因的抑制程度,获得能有效抑制USE1基因的慢病毒上清。结果显示,成功构建3种靶向USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,获得滴度符合要求的3种慢病毒包装上清液,感染HEK-293细胞后发现,第2、3号shRNA序列均有明显抑制表达USE1基因效果,基因表达抑制率约50%(*P<0.05)。利用RNA干扰技术成功构建了特异性抑制泛素结合酶USE1基因表达的慢病毒载体,并经mRNA和蛋白水平检验得到2种能够显著抑制USE1表达的慢病毒上清及其shRNA序列。
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