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摘要
目的观察降钙素相关基因肽(CGRP)对骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖及成骨分化能力的影响,探讨其促进骨质疏松性骨折愈合的细胞/分子作用机制。方法3个月龄SD大鼠,行双侧卵巢切除术,术后常规喂养,术后6个月用显微CT(Micro-CT)行骨密度检测,确定骨质疏松模型建立成功;处死骨质疏松大鼠,采用全血贴壁法分离BMSCs,用流式细胞仪进行鉴定;以培养基中加入不同浓度(10-710-10mol/L)的CGRP建立实验组,用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖能力;碱性磷酸酶(ALP)活性检测及茜素红染色法观察CGRP对骨质疏松大鼠BMSCs成骨分化及细胞外基质矿化能力的影响;采用反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测ALP、Ⅰ型胶原蛋白(COLL-1)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨粘连蛋白(Osteonectin)、Run家族转录因子(RunX2)等成骨相关细胞基因mRNA的表达;使用Western blot分析来检测RunX2及Osteonectin的蛋白含量。结果成功分离培养出骨质疏松大鼠BMSCs;CCK-8法测定细胞增殖能力,CGRP各浓度组较对照组均增加,且呈剂量依赖关系,7 d时对照组吸光度(A)值为0.580 4±0.015 0,CGRP组中10-7mol/L为0.804 1±0.029 9(P=0.000),10-8mol/L为0.788 6±0.028 0(P=0.000),10-9mol/L为0.7436±0.0288(P=0.001),10-10mol/L为0.6933±0.0292(P=O.004),差异有统计学意义;ALP活性测定结果显示,各CGRP组较对照组ALP活性均增高,14 d时对照组为4.633±0.423,CGRP组中10-7mol/L为44.047±2.446(P=0.000),10-8mol/L为42.030±2.626(P=0.000),10-9mol/L为39.333±0.527(P=0.000),10-10mol/L为24.647±1.135(P=0.000)[单位:10-3μmol/(min·mg)],差异有统计学意义;钙结节染色均呈阳性,而对照组无显色;基因检测结果提示,各CGRP组的基因表达较对照组升高,7 d时ALP空白组为0.999 5±0.205 0,10-7mol/L为2.578 4±0.210 1(P=0.001),10-10mol/L为2.351 2±0.201 2(P=0.001);BMP-2空白组为0.9795±0.2001,10-7mol/L为3.4279±0.2552(P=0.000),10-10mol/L为2.9149±0.202 3(P=0.000);COLL-I空白组为1.029 5±0.2022,10-7mol/L为2.518 7±0.240 0(P=0.001),10-10mol/L为2.347 8±0.201 4(P=0.001);RunX2空白组为0.993 2±0.213 2,10-7mol/L为2.498 9±0.262 0(P=0.002),10-10mol/L为2.219 8±0.250 3(P=0.003);Osteonectin空白组为1.019 5±0.200 1,10-7mol/L为1.972 8±0.212 3(P=0.005),10-10mol/L为1.864 2±0.250 1(P=0.010),差异有统计学意义;蛋白检测结果提示各CGRP组的RunX2及Osteonectin蛋白表达较对照组均升高。结论适当浓度(10-710-10mol/L)的CGRP可以促进骨质疏松大鼠BMSCs的增殖,呈浓度依赖性,同时可提高其成骨分化能力,CGRP可能在治疗骨质疏松骨折的骨修复中发挥重要作用。
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单位广西医科大学第四附属医院; 柳州市工人医院
