德州驴HO-1基因生物信息学分析及多克隆抗体制备

作者：胡乐玉; 胡欣瑶; 李颖; 赵盛淼; 沈凤臻; 王长法; 李亮亮; 王彤彤^*; 任慧英^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(04): 1499-1510.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.04.022

• 德州驴
• HO-1基因
• 原核表达
• 多克隆抗体
• 组织表达

【目的】克隆德州驴血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因，对其进行原核表达及多克隆抗体制备，同时检测HO-1基因在德州驴不同组织中的表达情况，为后期研究HO-1基因功能提供支撑材料。【方法】参考GenBank中公布的马HO-1基因序列(登录号：XM＿023631135.1)设计特异性引物，从驴原代肺泡巨噬细胞(donkey primary alveolar macrophages, DPAMs)中提取RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增HO-1基因编码区(coding sequences, CDS),对测序所获序列与其他物种进行相似性比对并构建系统进化树；应用多种在线软件对HO-1基因编码蛋白进行生物信息学分析。将HO-1基因序列克隆至pCold-SUMO载体进行原核表达，经镍柱亲和层析纯化后，以重组的HO-1蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，利用ELISA和Western blotting检测多克隆抗体特异性及与抗原结合的最大稀释度。利用免疫组化试验检测德州驴4种组织中HO-1蛋白的表达水平。【结果】德州驴HO-1基因CDS区全长873 bp,编码290个氨基酸，其氨基酸序列与马的相似性最高，亲缘关系最近，与鸡的相似性最低，亲缘关系最远。德州驴HO-1蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白，分子质量为33.04 ku,无信号肽，存在1个跨膜区，二级结构以α-螺旋为主。ELISA、Western blotting结果显示，针对HO-1制备的多克隆抗体与HO-1结合最大的稀释度为1∶102 400,宿主HO-1蛋白可被制备的多克隆抗体识别。免疫组化结果显示，德州驴4种组织中均有效表达HO-1蛋白。【结论】本研究成功获得德州驴HO-1重组蛋白，并制备特异性多克隆抗体，为后续深入探究HO-1基因在马属动物感染病原过程中的作用提供参考依据。

• 单位
  青岛农业大学; 聊城大学