三维荧光技术在肌氨酸氧化酶活性蛋白检测中的应用

作者：孟繁松; 林文萱; 张玲; 冯守帅; 杨海麟^*

来源：分析试验室, 2021, 40(11): 1257-1264.

DOI：10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2021.020105

• 三维荧光光谱
• 肌氨酸氧化酶
• FAD
• 蛋白浓度

利用三维荧光检测肌氨酸氧化酶(SOX)内源荧光物质的特征峰,探究SOX热失活机理以及在粗酶液中快速检测活性蛋白的应用。采集色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和SOX三维荧光光谱数据,确定SOX中Trp、Tyr和FAD内源荧光峰位置。考察不同温度(30℃～90℃)热处理15 min后SOX内源荧光峰位置和强度变化,建立FAD荧光强度与SOX活性蛋白浓度之间的线性关系模型,在重组菌粗酶液中验证方法可行性。结果表明:SOX中主要存在氨基酸残基和FAD两种内源荧光特征峰。光电信增管(PMT)电压400 V下检测氨基酸荧光峰,在热处理过程中,随着温度升高,氨基酸荧光峰波长范围基本不变,荧光强度从592.75 a. u.增加到1104 a. u.。PMT电压700 V下检测FAD荧光峰,30℃～55℃热处理后SOX样品中FAD荧光峰波长范围不变,荧光强度从890.16 a. u.下降到804.21 a. u.; 60℃～90℃时,FAD荧光峰变为游离态FAD特征峰,荧光强度从115.72 a. u.增加到142.13 a. u.,高温使FAD由结合态转为游离态,导致酶蛋白基本失活。根据SOX中FAD特异性荧光峰和荧光强度可预测粗酶液中SOX活性蛋白浓度。室温下,FAD荧光强度与SOX活性蛋白质量浓度在0.05～1.0 mg/mL范围内线性关系良好,拟合曲线R2=0.9929。经验证,曲线预测均方根误差(RM SEP)为0.0978,平均浓度回收率为99.7%。通过检测SOX特异性的内源FAD三维荧光,不仅能解析SOX的热失活机理,还能根据FAD荧光强度快速测量粗酶液中SOX蛋白浓度,为其他以FAD为辅酶的黄素类蛋白快速检测分析提供借鉴。

• 单位
  工业生物技术教育部重点实验室; 江南大学