BIGH3基因定点突变体R555W的构建及其对人角膜上皮细胞的影响

作者：葛红岩; 宋甄; 施展; 刘平

来源：中华眼科杂志, 2010, 46(1): 56-61.

DOI：10.3760/cma.j.issn.0412-4081.2010.01.013

• 转化生长因子β
• 细胞外基质蛋白质类
• 诱变
• 定点
• 上皮
• 角膜
• 上皮细胞
• 转染
• 细胞凋亡

目的 构建野生型BIGH3和突变型R555W-BIGH3基因的真核表达载体,探讨其过表达对人角膜上皮细胞的影响.方法 以pMD18-T/BIGH3载体为模板扩增野生型BIGH3基因全长编码序列,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP上,采用快速体外定点诱变技术获得R555W突变体.瞬时转染体外培养的人角膜上皮细胞,免疫印迹检测野生与突变型BIGH3基因的表达,流式细胞仪和透射电镜定量和定性检查细胞凋亡,分析caspase3活性.多组间数据采用单因素方差分析进行统计学处理.结果 PCR成功扩增了野生型和R555W突变型的BIGH3基因.荧光显微镜下可见成功转染BIGH3/R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP的CRL-11135细胞发绿色荧光,转染率为30.1%.瞬时转染48 h后的HCE细胞的上清液及其细胞裂解液免疫印迹分析显示,BIGH3/R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP两组免疫印迹条带的密度比分别为1.26±0.06和1.27±0.08.正常HCE细胞组、转染pIRES2-EGFP空质粒及BIGH3-pIRES2-EGFP细胞凋亡率分别为(1.49 ±0.02)%、(1.53 ±0.02)%、(1.50 ±0.06)%,转染R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP组细胞凋亡率达到19.46%±0.08%.差异有统计学意义(F=175 261.23,p<0.01).透射电镜下可见转染组细胞核内染色质凝集,固缩,分布于核膜下,核仁消失,有的胞核碎裂,细胞呈典型的凋亡改变.转染R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP组caspase-3活性为561.03 ±1.05,与其他组相比,差异有统计学意义(F=629 347.38,P<0.01).结论 应用快速体外定点诱变技术,成功获得突变型R555W-BIGH3基因,转染人角膜上皮细胞后,通过caspase3途径引起细胞凋亡.

• 单位
  第一临床医学院; 哈尔滨医科大学