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摘要
为建立猫杯状病毒(FCV)基于重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)结合CRISPR-Cas12a系统及侧向流层析试纸条(LFS)(RAA-CRISPR/Cas12a-LFS)的快速检测的方法，本研究基于FCV衣壳蛋白(VP1)基因序列保守区设计RAA引物、4对针对VP1靶标的扩增引物、4对VP1-cr RNA扩增引物和1条报告探针。利用4对VP1-crRNA扩增引物经退火和T7 RNA聚合酶转录合成4条靶标crRNA:VP1-1/2/3/4-crRNA，利用4对VP1靶标扩增引物经退火合成4条靶标双链DNA:VP1-1/2/3/4，经EnGen?Lba Cas12a (Cpf1)核酸酶试剂的切割反应和Cas12a试纸条检测，根据出现条带的强弱筛选最佳VP1-crRNA。结果显示，VP1-2-crRNA对应的T线条带最强且C线不完全切割的条带最弱。因此选择VP1-2-crRNA进行后续试验。分别以FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA为模板，利用RAA引物扩增其VP1基因，并通过琼脂糖凝胶电泳检测并评估RAA引物的扩增效果；利用Cas12a (Cpf1)核酸酶，以上述RAA扩增的VP1基因(来自FCV VR-782株RNA)为模板，在37℃恒温水浴30 min进行CRISPR/Cas12a-LFS检测，评估RAA产物、Cas12a、VP1-2-crRNA和ss DNA报告基团对CRISPR/Cas12a-LFS检测体系的重要性。RAA扩增效果的评估结果显示，从FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA中均扩增到282 bp的VP1基因目的条带。重要性评估结果显示，只有上述4种试剂全部存在时CRISPR/Cas12a-LFS检测体系才能有效扩增。利用该方法检测FCV、猫疱疹病毒I型、支气管败血波氏菌、猫细小病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、F81细胞，结果显示，该方法仅能够特异性检测FCV，而其他病原的检测结果 均为阴性，且分别在42℃30 min内和37℃40 min内完成对FCV的RAA扩增及CRISPR/Cas12a-LFS检测；利用该方法检测10倍倍比稀释的重组质粒标准品p MD18T-FCV-VP1以评估其敏感性，结果显示，该方法的检测限为37.5拷贝/μL，与本研究室建立的Taq Man荧光定量PCR方法的敏感性相当；分别利用同一批次和3批次配置的RAA-CRISPR/Cas12a-LFS体系分别检测不同浓度的重组质粒标准品p MD18T-FCV-VP1，以评估该方法的重复性，结果显示，该方法批内和批间重复性检测结果均一致；利用该方法和Taq Man荧光定量PCR方法同时检测临床采集的76份猫呼吸道拭子样品。结果显示，该方法检测到37份FCV阳性样品，39份阴性样品；Taq Man荧光定量PCR检测到36份FCV阳性样品，40份阴性样品。二者的阳性符合率达97.30%，阴性符合率97.50%，总符合率98.68%。本研究初步建立的FCV RAA-CRISPR/Cas12a-LFS检测方法简单、快速，且特异性强、敏感性高、重复性好、不依赖昂贵设备，为现场FCV的检测提供新的技术手段。
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单位吉林大学; 江苏农牧科技职业学院
