兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫PCR检测靶标的筛选与单一、多重直接PCR检测方法的建立

作者：肖洁; 罗跃军; 陈浩; 蒲家艳; 何维; 熊常明; 郝哥; 任永军^*; 杨光友^*

来源：畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4327-4337.

• 兔
• 斯氏艾美耳球虫
• 肠艾美耳球虫
• 大型艾美耳球虫
• ITS
• 直接PCR

旨在建立快速、简便的兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫直接PCR检测方法。首先克隆斯氏艾美耳球虫线粒体基因组mtDNA和3种兔球虫顶质体基因rpoB,结合GenBank中收录的其它兔球虫的相关序列进行比对分析，然后以种间差异明显的序列为靶基因在其超变区设计多对特异性引物，同时对引物浓度等条件进行优化，并评价PCR方法的敏感性和特异性。本研究首次测定了斯氏艾美耳球虫线粒体基因组全序列和3种兔球虫顶质体基因rpoB的序列，斯氏艾美耳球虫mtDNA全长6 277 bp,包括3个蛋白质基因，与其它6种兔球虫mtDNA序列相似率为93.90%～97.45%;斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫顶质体基因rpoB大小在500 bp左右，三者相似性达93.93%～95.30%。靶基因筛选结果表明3种兔球虫ITS与其它基因(rpoB和mtDNA)相比较具有种内保守和种间差异大的特点，更适合用于分子诊断；基于3种兔球虫ITS序列的引物中，Ps1、Pi2、Pm2在单一或多重检测时均具有良好的特异性和敏感性。本试验通过对艾美耳球虫PCR检测候选基因靶标(ITS、mtDNA和rpoB)进行序列分析，筛选ITS为兔球虫种间差异明显的检测靶标基因，在此基础上建立的单一直接PCR方法和多重直接PCR方法具有特异、敏感、操作简便的优点，可用于3种兔球虫的流行病学调查或兔球虫病临床诊断。

• 单位
  四川省畜牧科学研究院; 四川农业大学