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摘要
目的:基于特异性引物设计和高分辨率熔解曲线(HRM)技术建立藏成药石榴健胃散中不同药味的HRM鉴别方法。方法:以原料药相同或相近物种的ITS2序列作为模板，按照引物设计原则，利用Primer Primer 6.0软件进行引物设计；利用琼脂糖凝胶电泳方法，筛选对目标原料药扩增效果较好的特异性引物；利用HRM方法对琼脂糖凝胶电泳检测筛选出的特异性引物进行验证，比较自制石榴健胃散成药与市售石榴健胃散检测结果的一致性；优化HRM实验的扩增循环数，并确定各原料药的最佳特异性引物，建立较为专属性的特异性HRM方法。结果:实验设计了52对特异性引物，通过琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出了具有较好扩增特异性的11对特异性引物；采用HRM方法对琼脂糖凝胶电泳检测结果筛选出的11对特异性引物进行验证，其结果的特异性与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致，且以11对特异性引物检测自制石榴健胃散成药与市售石榴健胃散的结果一致；确定五味原料药中最佳特异性引物，石榴子为SLZ-7A7S(32 cycles),红花为HH-2A2S(25 cycles),肉桂为RGCA-1A1S(40 cycles),豆蔻为DKAC-1A1S(27 cycles),荜茇为BBPBN-1A1S(35 cycles)。结论:最终确定了石榴健胃散中各个原料药HRM检测方法的最佳扩增引物及最适扩增循环数，实现了对石榴健胃散中各个原料药较为专属性的鉴别，为原粉入药的中成药的分子生物学质量控制提供了研究思路及参考依据。
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单位中国药科大学; 中国食品药品检定研究院
