犬造血干细胞分离、鉴定和培养特性研究

作者：严涵; 田仰清; 昂艳芬; 汪娅媛; 张学峰; 严玉霖^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(07): 2678-2687.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.07.009

• 犬造血干细胞(cHSCs)
• 分离
• 纯化
• 体外培养

【目的】研究骨髓来源的犬造血干细胞(cannie hematopoietic stem cells, cHSCs)的分离、鉴定和培养特性，建立体外培养最优条件，为临床应用奠定理论基础。【方法】取3月龄犬骨髓，采用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),通过流式细胞仪分选cHSCs并进行体外悬浮培养。用CCK-8法检测cHSCs在不同培养基、不同浓度胎牛血清(FBS)、不同细胞因子、不同cHSCs与cBMSCs接种比例条件下的细胞活性，筛选最优体外培养方案。使用台盼蓝染色计数法统计体外共培养1、7、14、21 d后cHSCs增殖情况。利用流式细胞术和实时荧光定量PCR分别检测P0、P1、P2和P3代cHSCs表面标志物CD34分子阳性百分比以及干性基因性别决定相关基因簇2(SOX2)和八聚体结合蛋白-4(OCT-4)的mRNA表达水平。【结果】成功分离获得cHSCs,不同培养基中细胞活性无显著差异(P>0.05);不同浓度FBS中，5%FBS组cHSCs活性显著低于10%、15%、20%FBS组(P<0.05),10%FBS组cHSCs活性显著低于20%FBS组(P<0.05);不同细胞因子条件下，TPO+FLT-3+SCF+IL-6组cHSCs活性显著高于TPO组和TPO+FLT-3组(P<0.05);不同cHSCs与cBMSCs接种比例条件下，1∶10组cHSCs活性极显著高于1∶5、5∶1和10∶1组(P<0.01),5∶1接种组cHSCs活性极显著高于1∶5和10∶1组(P<0.01)。通过筛选的最优培养方案进行体外共培养，第7天时cHSCs进入对数生长期且达到高峰，其中cHSCs+cBMSCs+细胞因子组细胞数量显著高于cHSCs+细胞因子组(P<0.05)。随着cHSCs传代培养，细胞分化潜能发生了变化，P1、P2、P3代细胞CD34分子阳性百分比、SOX2基因mRNA表达水平均极显著低于P0代(P<0.01),P1、P2代OCT-4基因mRNA表达水平极显著高于P0代(P<0.01),P1代OCT-4基因mRNA表达水平极显著高于P2代(P<0.01)。【结论】本研究成功从犬骨髓中分离出cHSCs,筛选的cHSCs体外增殖最优培养条件为含10%FBS的IMDM培养基、cHSCs与cBMSCs接种比例为1∶10,同时联合添加TPO+FLT-3+SCF+IL-6细胞因子，P1代cHSCs处于对数生长期且CD34阳性百分比较高，可为今后临床应用提供参考。

• 单位
  云南农业大学