CircPTK2调节miR-761/CPEB2轴对结直肠癌细胞顺铂耐药性的影响

作者：徐晓忠; 赵飞龙^*

来源：热带医学杂志, 2023, 23(12): 1645-1796.

• 结直肠癌
• 环状RNA蛋白酪氨酸激酶2
• 顺铂耐药
• miR-761
• 细胞质多聚腺苷酸结合蛋白2

目的 探讨环状RNA蛋白酪氨酸激酶2(circPTK2)对结直肠癌（CRC）细胞顺铂（DDP）耐药性的影响。方法收集56例CRC样本（CRC组）及癌旁正常组织样本（对照组），体外培养人CRC细胞系（LoVo、HT-29、HCT116、SW480和SW620）和人正常结直肠粘膜细胞系（FHC），并建立DDP耐药的HCT116细胞（HCT116/DDP）。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织/细胞中circPTK2、miR-761和细胞质多聚腺苷酸结合蛋白2(CPEB2)mRNA表达。取HCT116/DDP细胞分为对照（Control）组、si-NC组、si-circPTK2组、si-circPTK2+inhibitor-NC组、si-circPTK2+miR-761 inhibitor组。细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测量各组细胞活力和DDP的半数抑制浓度（IC50）和增殖能力；流式细胞术检测细胞凋亡；Transwell检测细胞迁移或侵袭数；Western blot检测细胞中CPEB2蛋白表达；qRT-PCR检测circPTK2水平；starBase数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-761与circPTK2或CPEB2的互补位点；将含有miR-761结合位点的circPTK2或CPEB2 3’UTR的野生型（WT）序列克隆到psiCHECK-2载体中以形成相应的荧光素酶报告载体（WT-circPTK2和WT-CPEB2），双荧光素酶报告基因分析系统检测荧光素酶活性；RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）测定Ago2或IgG RIP复合物中circPTK2、miR-761和CPEB2的富集水平。结果 与对照组比较，CRC组患者癌组织中circPTK2、CPEB2 mRNA表达水平升高[（2.03±0.36）vs.(1.02±0.13)、（2.55±0.44）vs.(1.01±0.12)]，而miR-761表达水平降低[（0.41±0.07）vs.(1.00±0.10)]，差异均有统计学意义（P均<0.001）。Pearson相关性分析结果显示，CRC患者癌组织中circPTK2表达水平与miR-761水平成负相关（r=-0.766,P<0.001）;miR-761表达水平与CPEB2 mRNA表达成负相关（r=-0.866,P<0.001）,circPTK2的表达与CPEB2 mRNA表达成正相关（r=0.653,P<0.001）。DDP耐药患者癌组织中circPTK2、CPEB2 mRNA表达水平高于DDP敏感患者，而miR-761表达水平低于DDP敏感患者，差异均有统计学意义（t=12.983、10.352、12.459,P均<0.001）。与FHC细胞比较，CRC细胞系（LoVo、HT-29、HCT116、SW480和SW620）中circPTK2和CPEB2 mRNA的表达水平显著升高，miR-761的表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P均<0.001）；且HCT116细胞中circPTK2和CPEB2 mRNA的表达水平高于其他CRC细胞系，miR-761的表达水平低于其他CRC细胞系，因此，选择HCT116细胞进行后续实验。与Control组和siNC组比较，si-circPTK2组circPTK2、CPEB2 mRNA和蛋白水平显著降低，miR-761水平显著升高，差异均有统计学意义（P均<0.05）；与si-circPTK2组、si-circPTK2+inhibitor-NC组比较，si-circPTK2+miR-761 inhibitor组CPEB2 mRNA和蛋白水平显著升高，miR-761水平显著降低，差异均有统计学意义（P均<0.05）。与Control组和si-NC组比较，sicircPTK2组HCT116/DDP细胞中DDP的IC50、细胞增殖活力（48、72 h）、迁移细胞数和侵袭细胞数降低，差异均有统计学意义（P均<0.05）；与si-circPTK2组、si-circPTK2+inhibitor-NC组比较，si-circPTK2+miR-761 inhibitor组HCT116/DDP细胞中DDP的IC50、细胞增殖活力（48、72 h）、迁移细胞数和侵袭细胞数升高，差异均有统计学意义（P均<0.05）。与Control组和si-NC组比较，si-circPTK2组HCT116/DDP细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（P均<0.05）；与si-circPTK2组、si-circPTK2+inhibitor-NC组比较，si-circPTK2+miR-761 inhibitor组HCT116/DDP细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（P均<0.05）。生物信息学分析显示，circPTK2和miR-761存在靶向结合序列；双荧光素酶检测结果显示，与转染miR-NC比较，转染miR-761 mimic后，含有WT-circPTK2质粒细胞的荧光素酶活性降低，差异有统计学意义（P<0.05）;RIP检测结果显示，相对于lgG,circPTK2和miR-761在Ago2免疫沉淀中富集（P<0.05）。生物信息学分析显示，CPEB2的3’-UTR序列包含miR-761的结合位点；双荧光素酶检测结果显示，与转染miR-NC比较，转染miR-761 mimic后，含有WT-CPEB2质粒细胞的荧光素酶活性降低（P<0.05）;RIP检测结果显示，相对于lgG,miR-761和CPEB2在Ago2免疫沉淀中富集（P<0.05）。结论 circPTK2敲低可增强耐药CRC细胞对DDP的敏感性，其作用机制可能与调节miR-761/CPEB2轴有关。

• 单位
  张家港市中医医院