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摘要
【目的】副结核病被世界动物卫生组织（OIE）列入必须报告的《OIE疫病、感染及侵染名录》，我国将其列为二类动物疫病，引起多种反刍动物慢性、增生性肠炎，感染动物通过肠道间歇性排菌而成为养殖场的持续传染源，给养殖业带来了巨大经济损失。其病原体副结核分枝杆菌（MAP）属于胞内寄生的革兰氏阳性菌，为三类动物病原微生物，包括S型（羊型，细分为Ⅰ型、Ⅲ型和骆驼型）和C型（牛型、Ⅱ型，包括B型（野牛型））。有研究表明，各亚型MAP无宿主特异性，但具有地域性，内蒙古作为国内该病的首发地区，获得并准确鉴定内蒙古地区MAP菌株亚型及基因特征，对副结核病的预防控制意义重大。【方法】对内蒙古地区来源的28份MAP阳性的羊源病料进行MAP分离培养，菌落Ziehl-Neelsen染色，染色阳性菌扩繁，提取扩繁菌液基因组DNA，进行IS900基因、IS1311基因和DMC基因扩增、测序和序列分析，同时IS1311基因PCR产物进行Hinf I和Mse I双酶切鉴定。【结果】28份样品经过7—12周培养，共有9支培养基长出菌落，菌落半透明乳白色、表面光滑。挑取单菌落进行抗酸染色，在显微镜下观察到呈不规则（单个或分枝状）、红染的细短杆菌，符合分枝杆菌的形态学特征及抗酸染色特性。9株分离菌IS900、IS1311和DMC基因PCR扩增产物均与目的基因片段预期大小一致。确定了本研究9株分离株均为MAP菌株，分别命名为MAP-NM1至MAP-NM9。DMC基因扩增产物大小为310bp，符合Ⅱ型MAP特征；IS1311基因扩增产物经HinfⅠ和MseⅠ双酶切，本研究9株MAP均得到4条目的条带，与Ⅱ型MAP一致；IS1311基因测序结果与S型、C型、印度野牛型和美国野牛型MAP代表株对照分析显示，9株MAP IS1311基因片段的64、65、68、223、236、422、527、628位碱基位点符合C型和B型MAP特征；IS900基因测序结果序列分析显示，9株MAP IS900基因片段第169位及第216位碱基分别为C（胞嘧啶）和A（腺嘌呤），符合Ⅱ型和Ⅲ型MAP特征；17株来自GenBank数据库的MAP IS900基因参考序列与本研究9株分离株IS900基因系统进化树显示，本研究9株MAP均划分于Ⅱ型MAP分支；3个基因测序结果进行Blast在线分析，与本研究所得分离株同源性最高的参考序列均为Ⅱ型MAP，且同源性均高于98%。综上所述，本研究9株MAP分离株均为Ⅱ型MAP。【结论】首次分离得到内蒙古地区羊源Ⅱ型MAP菌株。
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