本发明属于蛋白纯化技术领域,具体为一种制备高稳定性的非对称二甲基精氨酸水解酶的方法。它将非对称二甲基精氨酸水解酶装入阴离子交换色谱柱,注入该柱至少一种三羟甲基氨基甲烷缓冲液,该缓冲液中的阴离子浓度高于色谱柱的阴离子浓度,由此去除杂蛋白并从该柱洗脱纯化的非对称二甲基精氨酸水解酶。在实施案例中,通过4个离子浓度的缓冲液,阴离子浓度大约在0mM-500mM之间的,因此形成离子浓度梯度,清除杂质,获得常温下长期稳定的高纯度非对称二甲基精氨酸水解酶。