高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b5还原酶I的克隆、表达和功能鉴定

作者：王明轩; 陈海琴; 顾震南; 陈卫; 陈永泉

来源：微生物学通报, 2016, 43(10): 2172-2178.

DOI：10.13344/j.microbiol.china.160116

• 细胞色素b5还原酶
• 细胞色素b5
• 高山被孢霉
• 脂肪酸脱饱和反应

【目的】鉴定产油微生物高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b5还原酶Ⅰ的功能。【方法】将高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b5还原酶Ⅰ基因与人可溶性细胞色素b5还原酶基因序列比对,去除该基因N端穿膜区域后,与人可溶性细胞色素b5基因分别在大肠杆菌中异源表达;通过钴离子亲和层析、离子交换和分子排阻色谱等方法对表达产物进行纯化;以2,6-二氯靛酚钠(DCIP)为底物,测定细胞色素b5还原酶Ⅰ的体外活性及其对NADH和NADPH的偏好性;在反应体系中存在NADH时,通过全波长扫描方法检测细胞色素b5还原酶Ⅰ与细胞色素b5的相互作用。【结果】高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b5还原酶Ⅰ被成功可溶表达,经纯化后检测到体外活性:使用NADH时酶活为564.57 U,使用NADPH时为51.97 U;在NADH存在时,细胞色素b5还原酶Ⅰ能够还原细胞色素b5,其吸收峰从411 nm偏移至422 nm,并在521 nm和554 nm处吸光值增加。【结论】细胞色素b5还原酶Ⅰ N端穿膜区域的去除增加了其可溶性,并保持了蛋白质活性;高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b5还原酶Ⅰ基因编码的是一种NADH-细胞色素b5还原酶,其在体外能与细胞色素b5相互作用。

• 单位
  食品科学与技术国家重点实验室; 江南大学