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摘要
目的通过体外T细胞识别自体树突状细胞(dendritic cell, DC)加工递呈的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)特异性抗原, 探讨靶向HBV-C、E、X基因的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)对体外靶细胞的特异性杀伤效应。方法利用基因重组技术分别将HBV-C、HBV-E、HBV-X三种抗原负载至腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)上, 获得重组腺相关病毒(recombinat adeno-associated virus, rAAV)。通过Ficoll法分离得到外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC), 经HBV-C-rAAV、HBV-E-rAAV、HBV-X-rAAV分别转染单核细胞并诱导分化为成熟DC。上述DC分4组, 分别为阴性对照组(未转染组)和HBV-C-rAAV/DC、HBV-E-rAAV/DC、HBV-X-rAAV/DC组(转染组)。通过流式细胞术检测rAAV的转染率, 并检测DC表面的标志分子和DC分泌的细胞因子白细胞介素(interleukin, IL)-10、IL-12。将体外培养的T细胞分别与未转染组DC、HBV-C-rAAV/DC、HBV-E-rAAV/DC、HBV-X-rAAV/DC混合, 利用混合淋巴细胞反应收获CTLs, 利用流式细胞术检测CTLs表面的标志分子以及分泌的细胞因子干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ), 并用3H-TdR掺入法检测T细胞的体外增殖能力。通过51Cr释放实验计算CTLs对靶细胞的杀伤率。结果对照组和转染组(HBV-C-rAAV/DC、HBV-E-rAAV/DC、HBV-X-rAAV/DC)中, HBV抗原阳性的DC比例分别为2.80%、85.12%、96.63%、98.42%。转染组中表达CD80的DC比例分别是55.26%、58.25%、59.63%, 表达CD83的比例分别是43.19%、48.73%、40.01%, 表达CD86的比例分别是95.46%、96.74%、83.62%, 分泌IL-12的比例分别是47.60%、52.50%、69.20%。经转染组DC诱导产生的T细胞亚群中, CD8+CD69+T细胞的比例分别为33.10%、31.50%、30.00%, CD4+CD25+T细胞的比例分别为11.89%、8.77%、10.87%, 分泌IFN-γ的比例分别为44.65%、45.16%、45.16%, T细胞体外增殖力(cpm值)分别为19 351、19 070、26 428。经转染组DC诱导产生CTLs对HBV抗原阳性的原代肝癌细胞(hepatoma cancer cells, HCC)组的杀伤率分别为61.18%、56.93%、65.05%, 对HBV抗原阴性的宫颈癌细胞组的杀伤率分别为4.62%、3.69%、4.34%, 对HCC+HBV抗体封闭组的杀伤率分别为34.90%、27.39%、30.66%, 对HCC+主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-Ⅰ类分子抗体封闭组的杀伤率分别为17.83%、21.47%、23.71%。转染组DC诱导产生的CTLs能有效杀死HBV抗原阳性的靶细胞, 在抗原表达下降后, 其杀伤能力显著减弱, MHC-Ⅰ类分子的缺失也会导致CTLs杀伤能力的明显降低。结论健康人外周血中分离出的单核细胞和淋巴细胞, 可在体外通过特定细胞因子的诱导、携带不同HBV基因片段的rAAV的转染和细胞共培养, 最终获得HBV特异性杀伤能力显著增强的CTLs, 且该类T细胞具有很强的细胞增殖能力, 有利于持续杀伤靶细胞;CTLs对靶细胞的杀伤作用依赖于HBV抗原和MHC-Ⅰ类分子的表达。
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