稳定表达GRIK3乳腺癌MDA-MB-231细胞株的筛选及鉴定

作者：吴伊雪; 肖斌; 孙朝晖; 陈丽丹; 黄晓燕; 李林海^*

来源：临床肿瘤学杂志, 2018, 23(11): 973-977.

• 乳腺癌
• GRIK3
• MDA-MB-231细胞株
• 稳定表达

目的构建稳定表达GRIK3的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,为研究GRIK3在乳腺癌中的生物学功能奠定基础。方法以非病毒质粒3×Flag-GRIK3为模板,PCR扩增目的基因,将目的基因与慢病毒载体表达质粒重组连接,重组质粒、包装质粒psPAX2以及包膜质粒pMD2.G共转染293T包装细胞,将获得的重组慢病毒感染乳腺癌MDA-MB-231细胞株,连续使用嘌呤霉素7天筛选稳定转染的细胞株。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况以鉴定稳定表达目的基因细胞株,采用QPCR和Western blotting分别检测稳定表达细胞株及空载体对照细胞中GRIK3的表达。结果 PCR成功扩增出目的基因,扩增后产物与慢病毒载体成功连接,连接后的重组慢病毒载体经DNA测序鉴定插入基因序列正确。重组慢病毒质粒、包装质粒psPAX2以及包膜质粒Pmd2.G成功转染293T细胞,收集的慢病毒能够成功转染MDA-MB-231细胞,并且在显微镜下能够观察到稳定表达GRIK3 MDA-MB-231细胞中明亮的绿色荧光。QPCR结果显示,GRIK3 mRNA在重组MDA-MB-231细胞中的表达水平为5. 443±0. 459,显著高于对照组的1. 0±0. 152,差异有统计学意义(P<0. 01)。Western blotting结果显示,GRIK3蛋白在重组MDA-MB-231细胞中的表达水平为2. 502±0. 092,高于对照组的0. 653±0. 032,差异有统计学意义(P <0. 01)。结论成功构建了重组GRIK3慢病毒载体,并筛选出稳定表达GRIK3蛋白的MDA-MB-231细胞株,为进一步探索GRIK3在乳腺癌发生、发展中的机制奠定了基础。