大鼠Fcγ RⅡb基因慢病毒的制备及其在BMDC细胞中的表达检测

作者：张武; 丁洋; 李立强; 李明皓^*

来源：宁夏医科大学学报, 2019, 41(02): 138-151.

DOI：10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2019.02.006

• FcγRⅡb
• 慢病毒表达载体和可诱导载体
• 诱导表达

目的构建大鼠FcγRⅡb慢病毒诱导表达载体,表达病毒与调节病毒共同感染大鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)并检测FcγRⅡb的表达。方法提取大鼠肝脏mRNA,并以其为模板通过逆转录及PCR获得FcγRⅡb基因片段,利用酶切重连技术构建慢病毒表达载体TRE与FcγRⅡb重组慢病毒载体。使用HEK293T细胞分别包装TRE-FcγRⅡb表达病毒与TET-on调节病毒,并检测其病毒滴度;离体诱导培养大鼠骨髓来源未成熟树突状细胞并鉴定。采用OX-62免疫磁珠分选大鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(i DC),用表达病毒和可诱导病毒共感染i DC。经一定梯度的强力霉素(DOX)诱导,分别用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印记法(WB)检测BMDC中FcγRⅡb mRNA水平及FcγRⅡb蛋白表达水平;免疫荧光检测树突状细胞中FcγRⅡb的表达;电镜对分离培养的BMDC进行形态学观察和鉴定。结果成功构建TRE-FcγRⅡb重组慢病毒载体,经酶切、PCR电泳条带鉴定成功,基因序列测定结果与GenBank比对同源性100%。体外诱导培养BMDC,5d左右观察到明显的树突样凸起。成功用慢病毒感染BMDC后,FcγRⅡb mRNA和FcγRⅡb蛋白水平均较未感染BMDC有明显的增高。结论成功制备了含大鼠FcγRⅡb基因慢病毒,用其感染未成熟树突状细胞并经DOX诱导可实现FcγRⅡb的高表达。

• 单位
  宁夏医科大学; 宁夏回族自治区人民医院