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摘要
为探究猪塞内卡病毒A(SVA)感染、干扰素(IFN-α)处理对猪肾细胞(PK-15)微RNA(microRNA,miRNA)转录谱的影响，本研究分别构建SVA感染的PK-15(PK-15/SVA)、IFN-α处理的PK-15 (PK-15/IFN),SVA感染再经IFN-α处理的PK-15细胞(PK-15/SVA/IFN)，通过荧光定量PCR(qPCR)分别检测各组细胞中SVA VP1及IFN-αm RNA的转录水平。结果显示，与PK-15相比，PK-15/SVA及PK-15/SVA/IFN细胞中SVA VP1基因的转录水平极显著升高(P<0.001),PK-15/SVA/IFN中IFN-α的转录水平显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01)。通过转录组测序技术(RNA-Seq)分析各组细胞mi RNA的转录谱，采用Spss软件统计各组细胞中转录差异miRNA的数量；利用基于负二项分布的DESeq2筛选各组细胞中转录显著差异mi RNA；采用miRanda、PITA和RNAhybrid 3个软件预测各组细胞转录显著差异miRNA的靶基因，通过miREvo和mirdeep2软件预测各组细胞中的新mi RNA并通过与猪mi RNA序列比对得到已知miRNA；分别采用GO功能和KEGG富集分析各组细胞转录显著差异miRNA涉及的生物学功能及信号通路。统计分析结果显示，与PK-15相比，PK-15/IFN、PK-15/SVA和PK-15/SVA/IFN中均存在转录显著差异miRNA，且在SVA感染后细胞中转录的mi RNA数量增多，IFN-α刺激则会减少细胞中转录的miRNA数量，SVA感染后再经IFN-α处理则转录的mi RNA数量又有所降低。筛选结果显示，与PK-15相比，PK-15/SVA中有167种转录显著差异miRNA，其中94种转录显著上调，73种转录显著下调；与PK-15相比，PK-15/IFN中有98种转录显著差异miRNA，其中55种转录显著上调，43种转录显著下调。预测结果显示，共有290种转录显著差异miRNA有对应靶基因，且共预测到292种新miRNA和345种已知mi RNA。选取6种转录显著差异miRNA采用Graphpad prism6.0进行miRNA-mRNA的互作网络展示。结果显示，miR-221-5p的靶基因显著多于其他miRNA，且其靶基因主要与癌症、病毒感染的治疗及宿主的免疫反应有关。GO功能结果显示，在经IFN-α处理或SVA感染后，转录显著差异miRNA的靶基因主要富集于细胞组分和生物过程等功能。KEGG分析结果显示，与PK-15相比，PK-15/SVA和PK-15/IFN细胞中转录显著差异mi RNA的靶基因主要富集于Rap1和NF-κB信号通路；与PK-15/IFN相比，PK-15/SVA/IFN细胞中转录显著差异mi RNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt、NF-κB和肿瘤坏死因子(TNF)等抗病毒免疫相关信号通路；与PK-15/SVA相比，PK-15/SVA/IFN细胞中转录显著差异miRNA的靶基因主要富集于Rap1、NF-κB、TNF和MAPK信号通路。16种转录显著差异mi RNA的q PCR结果与RNA-Seq结果一致。综上所述，本研究首次证实IFN-α处理、SVA感染均显著影响PK-15细胞miRNA转录谱，前者促进miRNA的转录，后者则抑制mi RNA的转录。其中转录显著差异miRNA的靶基因与宿主抗病毒及肿瘤免疫均等信号通路密切相关，该结果为阐明SVA感染宿主细胞后非编码RNA转录谱变化的分子机制研究奠定基础。
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