补肾活血汤调节rabHK-2外泌体对椎间盘髓核细胞凋亡及Wnt信号通路的影响

作者：冯帅华; 吴官保; 杨届; 万文渊; 孙湘云; 谢玉城; 廖建晖^*

来源：中药药理与临床, 2023, 39(05): 2-8.

DOI：10.13412/j.cnki.zyyl.20221108.001

• 补肾活血汤
• 外泌体
• 椎间盘退变
• 髓核细胞
• Wnt信号通路

目的:观察补肾活血汤对兔退变椎间盘组织细胞凋亡及Wnt信号通路的影响，以及调节兔肾小管上皮细胞(rabHK-2)来源外泌体的分泌，对退变椎间盘髓核细胞(NPCs)增殖、凋亡及Wnt信号通路蛋白表达的影响。方法:建立兔椎间盘退变模型，补肾活血汤干预8 w后，采用TUNEL法检测椎间盘组织凋亡阳性细胞率，Western-blot法检测椎间盘组织中Wnt信号通路相关蛋白的表达；5.41 g/kg补肾活血汤灌胃新西兰白兔制备含药血清，以10%补肾活血汤含药血清作用于rabHK-2细胞，采用超高速离心法提取rabHK-2细胞外泌体，透射电镜观察外泌体形态，Western-blot法检测外泌体标志蛋白集群分化因子9(CD9)和集群分化因子63(CD63)的表达；用PKH67荧光试剂盒标记后的外泌体与退变NPCs共孵育，荧光显微镜观察不同浓度外泌体作用于退变NPCs后，退变NPCs对rabHK-2细胞外泌体的摄取情况，CCK-8法检测退变NPCs活力。rabHK-2外泌体与补肾活血汤含药血清单独或联合干预后，应用流式细胞术检测退变NPCs凋亡情况，RT-PCR检测退变NPCs中II型胶原和蛋白多糖的mRNA表达，Western-blot和RT-RCR检测退变NPCs中Wnt信号通路相关蛋白和mRNA的表达情况。结果:补肾活血汤干预后，明显降低了兔退变椎间盘组织细胞凋亡率，并上调了Wnt通路中GSK-3β的蛋白表达，下调了β-catenin的表达(P<0.05);经补肾活血汤含药血清干预后，rabHK-2外泌体CD9、CD63的表达明显上调(P<0.05);不同浓度rabHK-2外泌体干预后，荧光显微镜可见外泌体被退变NPCs所摄取，退变NPCs细胞活力增强(P<0.05);外泌体与补肾活血汤含药血清联合干预后，退变NPCs凋亡率受到明显抑制，细胞中II型胶原和蛋白多糖的mRNA表达明显上调，同时显著上调了GSK-3β的蛋白和mRNA表达，下调了β-catenin的表达，联合补肾活血汤含药血清处理后效果较单独应用外泌体更为明显(P<0.05)。结论:补肾活血汤可能通过抑制Wnt信号通路的活化，减轻兔退变椎间盘组织细胞凋亡，同时能够增加rabHK-2细胞外泌体的分泌，并通过rabHK-2外泌体靶向调控退变NPCs的增殖、凋亡及Wnt信号通路的表达，从而延缓椎间盘退变。

• 单位
  湖南中医药大学; 湖南省中医药研究院附属医院