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摘要
目的利用CRISPR/Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞(HCT116细胞)中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系,检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lenti CRISPR v2-sgRNA Apak敲除质粒,进行慢病毒包装,感染HCT116细胞,嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平,筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lenti CRISPR v2-sgRNA Apak敲除质粒正确,蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强,Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系,便于后期Apak功能的研究。
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单位蛋白质组学国家重点实验室; 广东医科大学
