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摘要
目的:长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)已成为调控基因表达和影响多种生物学过程的关键表观遗传调控因子。在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的发生发展中,lncRNA发挥着重要作用,有关lncRNA在RA患者外周血细胞中的研究已有报道。然而,目前尚无lncRNA在RA患者中对于自噬调控的研究。本研究通过筛选RA滑膜成纤维样细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLSs)自噬前后差异表达的lncRNAs,寻找调节RA-FLSs自噬的关键lncRNAs,旨在为RA的诊断和治疗提供新方向。方法:获取6例RA患者膝关节或髋关节术后的滑膜组织,原代培养(组织块法)RA-FLSs至第5代,用mTOR抑制剂PP242处理后,通过蛋白质印迹法检测细胞自噬水平标记蛋白LC3-II表达水平的变化。其中3例采用TRIzol提取PP242处理前后RA-FLSs总RNA,应用Agilent Human ceRNA Microarray 2019(4×180 K,Design ID:086188)芯片检测,发现表达量显著改变的lncRNAs(差异倍数≥2.0,P<0.05)。利用生物信息学技术,对获得的差异表达的lncRNAs进行基因本体(gene ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,以发现差异表达的lncRNAs可能参与的生物学通路,探索差异表达的lncRNAs在RA发病机制中的作用。在前期芯片筛选出的lncRNAs差异表达的基础上,结合GO富集分析和KEGG分析,筛选出ENST00000584721.1、ENST00000615939.1,对全部6例RA-FLSs进行real-time RT-PCR验证。结果:从患者膝关节或髋关节滑膜组织中成功分离、培养出RAFLSs。6例RA-FLSs经过PP242处理后,自噬水平标记蛋白LC3-II表达水平升高(P<0.05),PP242诱导RA-FLSs发生自噬。芯片筛选共有591个差异表达的lncRNAs,其中表达上调的有428个,表达下调的有163个。GO分析显示这些差异表达的lncRNAs与Th17功能、T细胞相关细胞因子生成及TGF-β受体信号通路的负性调节,以及I型TGF-β受体结合和IL-6受体复合物形成等相关。KEGG分析显示自噬通路、TGF-β、TNF-α、IL-17信号通路以及Th17、Th1、Th2、破骨细胞分化通路是富集差异lncRNAs最多的几条信号通路。Real-time RT-PCR验证在RA-FLSs自噬后ENST00000584721.1表达上调(P<0.05),ENST00000615939.1表达下调(P<0.05),与芯片结果一致,证实芯片筛选差异基因可靠。GO分析显示ENST00000584721.1、ENST00000615939.1分别与核糖体转运和自噬体组装相关。KEGG分析显示ENST00000584721.1与丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶信号通路相关,ENST00000615939.1与FoxO信号通路相关。结论:通过基因芯片分析发现了RA-FLSs中差异表达的lncRNAs。在RA中,这些差异表达的lncRNAs参与RA-FLSs自噬的发生过程。生物信息学分析显示其作用机制可能包括调节多种细胞因子(IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-17等)分泌和免疫细胞(Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、破骨细胞等)分化,调控自噬通路、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶、FoxO等多种信号通路等。其中在RA-FLSs自噬后ENST00000584721.1表达上调,ENST00000615939.1表达下调,这为后续进一步深入研究lncRNA在RA-FLSs自噬中的作用机制提供了良好的实验基础。
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单位遂宁市中心医院; 四川省人民医院; 遵义医科大学
