幽门螺杆菌黏附素A的原核表达、纯化及其结晶条件搜索

作者：赵祥; 徐欢; 张欣; 熊昌辉; 马贤纵; 安家昆; 章金勇

来源：中国生物制品学杂志, 2014, 27(03): 325-329.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.000219

• 幽门螺杆菌
• 黏附素
• 原核细胞
• 基因表达
• 晶体

目的原核表达、纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素A(H.pylori adhesin A,HpaA),并初步搜索其结晶条件。方法采用TMHMM和SignalP-4.1软件预测HpaA蛋白中的跨膜序列和信号肽序列,根据GenBank中登录的编码HpaA的基因序列hp0797去掉预测出的信号肽序列后设计引物,以H.pylori标准株26695基因组为模板,PCR扩增编码HpaA的基因序列,插入原核表达载体pET-22b,构建重组表达质粒pET-22b-HpaA,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG 25℃诱导表达,表达的重组蛋白经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化。将纯化产物浓缩至10 mg/ml,采用结晶搜索试剂盒,通过悬滴汽相扩散法搜索HpaA的结晶条件,并在此基础上配制条件进行优化。结果去掉序列中编码信号肽区域或跨膜结构域的密码子,选择HpaA的36260位氨基酸进行克隆,构建的重组原核表达质粒pET-22b-HpaA经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白HpaA相对分子质量约27 000,表达量约占菌体总蛋白的10%以上,主要以可溶形式表达,纯化后的纯度可达99%以上。在多种条件下,均有结晶生长,晶体多为薄片状、针状或簇状,在20%PEG3350,0.1 mol/L HEPES(pH 7.0)条件下,晶体形状类似长方体,外形有所改善。结论成功表达了HpaA蛋白,初步掌握其结晶条件,为下一步晶体结构学的研究及其在H.pylori感染与致病中的作用机制奠定了基础。

• 单位
  第三军医大学