棉铃虫c-Myc基因的原核表达纯化、抗体制备、时空表达谱测定与功能分析

作者：索倩; 孙晓燕; 张莹; 王育婧; 刘凯于; 杨红; 洪华珠; 彭建新; 彭蓉

来源：生物工程学报, 2023, 39(07): 2730-2742.

DOI：10.13345/j.cjb.220764

• 棉铃虫
• Ha-c-Myc
• 原核表达
• SCP-2
• 时空表达谱
• RNA干扰
• 脂质代谢

细胞致瘤基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc)编码的c-Myc蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路调节相关基因的表达，近年来引起了广泛的研究关注。本研究旨在利用原核表达系统体外表达棉铃虫(Helicoverpa armigera)c-Myc(Ha-c-Myc)基因，制备多克隆抗体，明确Ha-c-Myc的时空表达模式，并探究Ha-c-Myc在调控棉铃虫胆固醇载体蛋白-2 (sterol carrier protein-2,SCP-2)基因表达中的潜在作用。通过PCR扩增Ha-c-Myc基因并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中，构建重组表达质粒pET-32a-Ha-c-Myc，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞，使用IPTG诱导蛋白表达，并通过Ni2+-NTA柱纯化重组蛋白，用重组蛋白免疫新西兰兔制备抗Ha-c-Myc多克隆抗体。利用实时荧光定量PCR (real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)法检测棉铃虫不同发育时期(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和预蛹期不同组织(中肠、脂肪体、头部和表皮)中Ha-c-Myc基因的表达水平。设计合成Ha-c-Myc siRNA并转染棉铃虫Ha细胞，通过qRT-PCR分析Ha-c-Myc基因的RNA干扰后棉铃虫Ha-c-Myc基因和HaSCP-2基因mRNA表达的情况。结果表明，本实验构建了pET-32a-Ha-c-Myc重组质粒，在大肠杆菌中获得了高效表达的、大小约为65kDa的可溶性Ha-c-Myc蛋白。经纯化得到纯度较高的蛋白，免疫新西兰兔制备了多克隆抗体，免疫印迹实验(Western blotting)表明抗体的特异性较好，酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析显示抗体具有较高的效价。qRT-PCR实验发现Ha-c-Myc基因在棉铃虫各发育阶段均有表达，在幼龄和大龄幼虫及预蛹中表达量较高，其中预蛹的表达量最高。组织表达结果显示，Ha-c-Myc基因在预蛹不同组织均有一定表达但存在差异，在中肠部位具有高表达，而在表皮和脂肪体表达水平较低。RNA干扰的结果显示，Ha-c-Myc表达的敲降对HaSCP-2基因的转录有较大影响，导致HaSCP-2基因的相对表达水平显著性降低了50%。上述研究表明，利用pET-32a(+)原核表达系统可以有效地表达可溶性Ha-c-Myc蛋白，并且制备高质量的抗Ha-c-Myc多克隆抗体。RNA干扰证明在中肠组织高表达的Ha-c-Myc能促进HaSCP-2基因的转录表达，在棉铃虫的脂质代谢中具有重要作用。本实验结果有助于深入研究Ha-c-Myc在棉铃虫中的潜在功能及其作用机理，为探究绿色农药的新型作用靶标提供实验数据。

• 单位
  华中师范大学; 生命科学学院