人源磷脂酶PLA2异源可溶表达纯化及酶学分析

作者：马文君; 滕琳; 田顺利; 郭校燕; 王培培; 郑春阳; 卫宏远

来源：食品工业科技, 2021, 42(02): 70-82.

DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020040039

• 人磷脂酶A2
• 载体构建
• 异源可溶表达
• 蛋白纯化
• 活性测定

为实现人源磷脂酶A2的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA2(PLA2G10),并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白(MBP)为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA2,转化E.coli BL21(DE3)后,经PTG低温诱导表达,SDS-PAGE鉴定后,确认其在上清中大量表达。根据蛋白的性质建立了一整套蛋白纯化工艺,包括Q柱洗脱,硫酸铵盐析,Phenyl柱纯化,Amylose柱纯化,分离纯化获得重组酶,SDS-PAGE测定该酶纯度大于90%。以卵磷脂为底物,酸碱滴定法测定其比活为127.04 U/mg,纯化得率48.8%,纯化倍数为10.3倍。酶学性质研究表明,该酶的分子量为56.5 kDa,最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,是钙离子依赖酶,对PC亲和能力最强,Km值为12.2 mmol/L,Vmax为0.19 mmol/L/min。本试验建立的磷脂酶A2的异源表达、纯化体系,为其进一步的理论和工业研究奠定了基础。

• 单位
  天津医科大学总医院; 天津大学