利用CRISPR/Cas9技术构建PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞系

作者：张家翔; 韩佃刚; 师亚玲; 毛晓月; 赵凯薇; 杜萱; 信吉阁^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(07): 2670-2677.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.07.008

• CRISPR/Cas9
• 过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)
• IPEC-J2细胞
• 基因敲除

【目的】利用CRISPR/Cas9技术敲除猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)基因，进而在细胞水平上研究PPARγ基因与肠道炎症反应相关的生物学机制。【方法】根据猪PPARγ基因序列(GenBank登录号：NM＿214379),在第2外显子区域设计2对sgRNA序列，经退火形成DNA双链后连接至真核表达载体gRNA＿GFP-T1;将构建成功的PPARγ正向打靶载体、反向打靶载体、Cas9-nickase质粒共转染至IPEC-J2细胞，经G418药物筛选获得单克隆细胞株，提取单克隆细胞株DNA后进行PCR扩增，经凝胶电泳鉴定后送测序；挑选基因敲除效果最佳的细胞株，利用免疫荧光法检测PPARγ蛋白表达情况。【结果】打靶载体测序结果显示，打靶序列正确连接；经转染、筛选后共获得48株单克隆细胞；测序结果显示，6株单克隆细胞出现双峰，分别为KO-15、KO-17、KO-21、KO-25、KO-32和KO-35;选择底峰较高的KO-25进行免疫荧光检测，结果显示PPARγ蛋白表达降低。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术成功获得了PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞，为后续进一步研究PPARγ基因在炎症反应中的功能奠定了基础。

• 单位
  云南农业大学