基于novel-miR1检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增方法的建立和应用

作者：陈国梁; 王立群; 李艳萍; 刘婷丽; 李红; 张少华; 骆学农; 强文军^*

来源：中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2023, 41(03): 294-299.

• 豆状囊尾蚴病
• novel-miR1
• 滚环扩增

目的 建立检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增（RCA）方法。方法 以家兔血清中豆状囊尾蚴来源的novel-miR1为诊断靶标，设计连接序列和锁式探针，并对连接序列和锁式探针的比例、反应时间、酶用量、 dNTP用量以及扩增反应时间等5个重要条件进行优化，建立检测豆状囊尾蚴感染的RCA方法。将novel-miR1标准品倍比稀释为1 fmol/L至100 nmol/L的9个不同浓度的样品，评价RCA方法的灵敏度。用优化后的RCA方法分别检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA各20份（实验室保存样品），并通过受试者工作特征（ROC）曲线分析其敏感性和特异性。20只雌性家兔每只经口感染1 000个豆状带绦虫虫卵，采集感染前和感染后每个月的家兔血样制备血清miRNA，用优化后的RCA方法进行检测，评价其应用效果。结果电泳结果显示，RCA扩增产物的DNA停留在加样孔中，形成一条明亮条带。反应条件优化试验结果显示，连接序列浓度为2μmol/L、锁式探针浓度为1μmol/L （连接序列和锁式探针的比为2∶1）、T4 DNA连接酶为350 U、连接180 min时连接效率最高。在100μl的扩增体系中，dNTP浓度为0.5μmol/L，扩增240 min时，RCA扩增效果最佳。优化后RCA的最低检测浓度为10 pmol/L。RCA检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA样品的平均荧光值分别为53.298±1.707和97.498±5.892，差异有统计学意义（t=7.206, P <0.01）。ROC分析结果显示，当阳性临界值为61.69时，RCA方法的敏感性和特异性均为95%,AUC为0.955 0，似然比为19.00。RCA检测豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA结果显示，20份感染前的血清中19份检测结果为阴性，1份为阳性；感染后1个月的血清中，17份为阳性，2份为疑似，1份为阴性；感染后2个月的血清，1份为阴性，其余为阳性；感染后3个月的血清，3份为阴性，其余为阳性。结论 建立了检测家兔豆状囊尾蚴感染的RCA方法，该方法在豆状囊尾蚴感染后3个月内的家兔血清中检出novel-miR1，具有良好的应用潜力。

• 单位
  家畜疫病病原生物学国家重点实验室; 中国农业科学院兰州兽医研究所