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摘要
目的探讨人羊膜上皮细胞外泌体(hAEC-Exo)对高糖环境下HaCaT增殖和迁移的作用及其相关机制。方法采用实验研究方法。取2019年1—6月于福建医科大学附属协和医院妇产科10名足月分娩健康孕妇羊膜组织, 分离原代人羊膜上皮细胞(hAEC)。观察培养第2、4、7天原代hAEC生长状态和形态改变, 采用流式细胞术检测细胞表面标志物CD73、CD90、CD29、CD34及人白细胞抗原DR(HLA-DR)的表达, 取第2～4代细胞用于后续实验。超速离心法分离hAEC-Exo。将HaCaT与hAEC-Exo共培养3 h, 采用倒置荧光显微镜观察HaCaT对hAEC-Exo的摄取情况。取HaCaT, 分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、hAEC-Exo组和二甲基亚砜(DMSO)+PBS组、DMSO+hAEC-Exo组、LY294002+hAEC-Exo组, 每组3孔, 并进行相应处理, 采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测培养0(即刻)、12、24、36、48、60 h细胞增殖活力;划痕试验检测划痕后0、24、48、72 h划痕愈合情况, 并计算划痕愈合率;Transwell实验检测培养48 h穿膜细胞数;蛋白质印迹法检测培养24 h后磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-Akt-mTOR)通路相关的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及独立样本t检验。结果原代hAEC培养第2天多数呈卵圆形, 大小均一;培养第4、7天, 细胞形态呈典型的鹅卵石样单层排列。原代hAEC高表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90及CD29, 不表达或低表达造血干细胞相关表面标志物CD34及HLA-DR。培养3 h, hAEC-Exo成功被HaCaT内吞入细胞质, 并聚集于细胞核周围。培养12、24、36、48、60 h, hAEC-Exo组HaCaT增殖活力明显高于PBS组(t=3.691、10.861、12.121、10.531、14.931, P<0.01)。划痕后24、48、72 h, PBS组HaCaT划痕愈合率明显低于hAEC-Exo组(t=3.342、6.427、5.485, P<0.05或P<0.01)。培养48 h, hAEC-Exo组HaCaT穿膜数显著多于PBS组(t=5.385, P<0.01)。培养24 h, hAEC-Exo组HaCaT中p-mTOR和p-Akt蛋白表达量明显高于PBS组(t=4.240、5.586, P<0.01), 2组HaCaT中mTOR和Akt蛋白表达量相近(P>0.05)。培养24 h, DMSO+hAEC-Exo组HaCaT中p-mTOR和p-Akt的蛋白表达量明显高于DMSO+PBS组(t=6.155、8.338, P<0.01)和LY294002+hAEC-Exo组(t=5.030、3.960, P<0.01), 3组HaCaT中mTOR和Akt蛋白表达量相近(P>0.05)。DMSO+hAEC-Exo组HaCaT培养12、24、36、48、60 h增殖活力为0.78±0.05、1.23±0.07、1.60±0.09、1.86±0.09、2.03±0.08, 明显高于DMSO+PBS组的0.46±0.04、0.69±0.07、0.98±0.08、1.16±0.08、1.26±0.11(t=4.376、7.398、8.488、9.766、10.730, P<0.01);DMSO+hAEC-Exo组HaCaT培养24、36、48、60 h增殖活力明显高于LY294002+hAEC-Exo组的0.96±0.09、1.20±0.08、1.39±0.08、1.55±0.10(t=3.639、5.447、6.605、6.693, P<0.05或P<0.01)。DMSO+hAEC-Exo组HaCaT划痕后24、48、72 h划痕愈合率明显高于DMSO+PBS组(t=4.003、6.349、7.714, P<0.01)和LY294002+hAEC-Exo组(t=3.805、4.676、4.067, P<0.05或P<0.01)。培养48 h, DMSO+hAEC-Exo组HaCaT穿膜数明显多于DMSO+PBS组和LY294002+hAEC-Exo组(t=7.464、1.232, P<0.01)。结论 PI3K-Akt-mTOR通路介导hAEC-Exo促进高糖环境下HaCaT增殖和迁移。
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单位福建医科大学附属协和医院
