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摘要
背景：将种子细胞接种于三维支架材料上然后在生物反应器中进行三维培养是一种常见的体外组织工程培养手段，但是生物工程血管构建过程中的细胞增殖变化及代谢模式尚不清楚。目的：探究利用体外生物反应器进行生物血管组织构建过程中细胞耗氧等代谢变化及其原因。方法：以自主搭建的血管生物反应器系统为平台，牛血管壁平滑肌细胞为种子细胞，常规CO2培养箱提供培养过程的外部气体环境。将种子细胞接种于管状多孔隙的聚乙醇酸支架材料上进行三维培养，全过程包括1周的静置期和7周脉动张应力刺激加载期。搭建一套非侵入式监测体系，采用光学溶解氧贴片法监测反应器中培养液溶解氧变化，并通过定期取样测定葡萄糖消耗量及乳酸生成量。采用CCK-8检测平滑肌细胞在聚乙醇酸三维支架材料上增殖情况，通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化态与还原态比值(NAD+/NADH)了解培养早期阶段细胞增殖与代谢状况，采用RT-qPCR、Western blot方法检测增殖相关基因(Ki67)及糖酵解相关基因(GLUT-1、LDHA)的表达。结果与结论：(1)从细胞加注到静置期结束(第1周)培养液的溶解氧水平为(4.314±0.380) mg/L，张应力刺激加载后(后7周)溶解氧水平逐步稳定在(1.960±0.866) mg/L，两者有明显变化(P <0.05);(2)细胞培养液中乳酸生成量与葡萄糖消耗量的比值YL/G在加注细胞后快速升高，第5天最高值高于1，随后缓慢下降至0.5(静置期YL/G均值为0.89，加压期均值为0.57,P <0.05);(3)CCK-8检测显示A450值在细胞加注之后逐渐增大，第5天达到最高值3.17，之后缓慢下降；同时发现Ki67 mRNA在培养第3天上调最显著，之后下降，Ki67蛋白在第3-5天的相对表达量较高；(4)细胞加注后第5-7天NAD+/NADH明显升高，糖酵解相关基因(GLUT-1、LDHA)表达上调同步改变，前5 d相对表达量较高；(5)结果提示：利用血管生物反应器构建组织工程血管早期，平滑肌细胞以增殖为主并呈现一种低耗氧的代谢特征，在脉动张应力刺激阶段呈现耗氧较高的代谢特征。
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