科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的 探讨苦参碱对食管癌Eca-109细胞自噬的影响及其可能的作用机制。方法 将传代培养的Eca-109细胞分为对照组、低浓度苦参碱组、中浓度苦参碱组和高浓度苦参碱组。对照组细胞加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，低、中、高浓度苦参碱组细胞分别加入终质量浓度为1.0、1.5、2.0 g·L-1的苦参碱溶液；采用四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞的活性，免疫荧光细胞化学染色法检测各组细胞中自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)的定位及表达，Western blot法检测各组细胞中多聚蛋白62(P62)、LC3蛋白的相对表达量，实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量，透射电子显微镜观察对照组和高浓度苦参碱组Eca-109细胞的超微结构。另取传代培养的Eca-109细胞，将细胞分为对照组、自噬抑制剂组、苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组。对照组细胞加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，自噬抑制剂组细胞加入终浓度为7μmol·L-1的3-甲基腺嘌呤(3-MA)溶液，苦参碱组细胞加入终质量浓度为2.0 g·L-1的苦参碱溶液，自噬抑制剂+苦参碱组细胞先加入终浓度为7μmol·L-1 3-MA溶液预孵育3 h,再加入终质量浓度为2.0 g·L-1苦参碱溶液；培养24 h后，采用Western blot法检测各组细胞中Beclin1、LC3和肝激酶B1(LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白的表达。结果 低、中、高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于对照组(P<0.05);中、高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。对照组、低浓度苦参碱组、中浓度苦参碱组和高浓度苦参碱组Eca-109细胞质中均可见到红色荧光标记的LC3蛋白阳性表达。对照组细胞中LC3蛋白呈弥散状态；各浓度苦参碱组细胞中LC3蛋白呈斑点状态，且苦参碱浓度越高，细胞质中呈斑点状LC3蛋白越多。低、中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量显著低于对照组(P<0.05);中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量显著低于低浓度苦参碱组(P<0.05);中浓度苦参碱组与高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。低浓度苦参碱组与对照组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05);中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于对照组和低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。低、中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。对照组细胞中可见正常的细胞质、细胞器和细胞核，高浓度苦参碱组细胞质中可见大量大小不等的自噬泡，并可见包裹有细胞内容物的自噬体。自噬抑制剂组与对照组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05);苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均显著高于对照组和自噬抑制剂组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均显著低于苦参碱组(P<0.05)。自噬抑制剂组Eca-109细胞中磷酸化LKB1(p-LKB1)/LKB1、磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK显著低于对照组，磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR显著高于对照组(P<0.05);苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于对照组，p-mTOR/mTOR显著低于对照组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于对照组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组与对照组Eca-109细胞中p-mTOR/mTOR比较差异无统计学意义(P>0.05)。苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于自噬抑制剂组，p-mTOR/mTOR显著低于自噬抑制剂组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著低于苦参碱组，p-mTOR/mTOR显著高于苦参碱组(P<0.05)。结论 苦参碱可能通过调节LKB1/AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达诱导食管癌Eca-109细胞发生自噬。
-
单位河北北方学院
