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摘要
旨在利用Piggy Bac转座子系统构建表达狂犬病病毒(rabies virus, RABV)糖蛋白(glycoprotein, G)的稳转细胞株，为复制缺陷型RABV的拯救与培养奠定基础。根据NCBI公布的RABV SRV9株G基因序列设计引物，利用PCR技术扩增RABV-G基因并将其克隆至真核表达载体YHM-spCas9,构建重组质粒YHM-SRV9-G。将重组质粒与Piggy Bac转座子酶辅助质粒共转染BSR细胞，利用20 mg/L灭瘟素S盐酸盐(blasticidin)连续筛选2周后获得有抗性的细胞簇。利用有限稀释法连续2次单克隆纯化后获得稳定表达RABV-G蛋白的单克隆细胞株BSR-G。PCR、间接免疫荧光及Western blot鉴定结果显示，BSR-G细胞携带RABV-G基因并可表达G蛋白，激光共聚焦结果显示RABV-G蛋白定位在细胞膜。将缺失G基因的重组狂犬病病毒(rSRV9-△G-eGFP)分别感染BSR和BSR-G细胞，发现rSRV9-△G-eGFP可在BSR-G细胞中增殖。本研究成功构建了稳定表达RABV-G蛋白的稳转细胞株BSR-G,为狂犬病复制缺陷型基因工程疫苗的研制奠定了基础。
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