牛结核分枝杆菌ESAT6-CFP10-BFH融合蛋白原核表达及皮试反应

作者：鲍佳鹏; 孙悦; 张建军; 苏岳乐; 毕力格; 郭宇; 巴依尔塔; 赵东辉; 陈彪; 冯紫佳; 郑可^*; 秦建华^*

来源：中国兽医学报, 2023, 43(12): 2502-2508.

DOI：10.16303/j.cnki.1005-4545.2023.12.15

• ESAT6-CFP10融合蛋白
• 牛结核分枝杆菌
• 提纯牛型结核菌素

为了改善ESAT6-CFP10融合蛋白检测牛结核分枝杆菌感染存在灵敏度低的问题，应用铁蛋白骨架显著性提升EC(ESAT6-CFP10)法的灵敏度，将ESAT6、CFP10和牛源铁蛋白重链(BFH)用柔性多肽连接，按照ESAT6-CFP10-BFH的串联组合方案设计基因序列，构建pET-28a-EC-BFH重组质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。使用自诱导培养基对铁蛋白EC融合抗原(EC-BFH蛋白)进行诱导表达，亲和层析镍柱法纯化EC-BFH蛋白，使用蛋白印迹(Western blot)对EC-BFH蛋白进行鉴定及纯度测定。将EC-BFH蛋白对健康豚鼠进行皮试，通过观察皮试部位是否会引起炎性反应，验证EC-BFH蛋白的特异性。对牛结核分枝杆菌致敏成功的豚鼠，以提纯牛型结核菌素(PPDB)作为对照，检测EC蛋白和EC-BFH蛋白效价对比阳性率。结果表明：EC-BFH蛋白的相对分子质量约为48.4 kDa,与预期相同，说明成功纯化EC-BFH蛋白。EC-BFH蛋白对健康豚鼠进行皮试24 h后无炎症反应，说明EC-BFH蛋白特异性良好。根据阳性率数据显示EC-BFH蛋白效价远远高于EC蛋白；在注射量为1,10和20μg时，EC-BFH蛋白皮试的阳性率均高于EC蛋白，尤其注射量在1μg时，EC蛋白和EC-BFH蛋白的阳性率分别为16.6%和100%,且EC-BFH蛋白与PPDB的阳性率接近。结果表明EC-BFH融合蛋白提高了EC法检测牛结核分枝杆菌感染的灵敏度，增强了皮试反应效果，作为检测牛结核分枝杆菌感染的诊断试剂有很大的研究价值。

• 单位
  内蒙古自治区动物疫病预防控制中心; 河北农业大学; 广西壮族自治区人民医院; 河北科技大学