酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞中OCT4与SOX2蛋白水平的影响

作者：孙潇智; 李爽; 金颖^*; 廖兵^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2021, 41(04): 413-420.

DOI：10.3969/j.issn.1674-8115.2021.04.001

• 人胚胎干细胞
• 细胞外基质
• 八聚体结合转录因子4
• 性别决定区Y框蛋白2
• 溶酶体
• 丝切蛋白

目的·探究酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)的八聚体结合转录因子4 (octamerbinding protein 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2 (sex determining region Y-box 2,SOX2)蛋白水平的影响及可能的作用机制。方法·(1)利用Western blotting分析检测酶消化细胞团块法[分散酶Dispase或胶原酶Ⅳ(collagenase typeⅣ,COL4)]、酶消化单细胞法(细胞分离溶液Accutase或胰酶)和机械刮取法对hESC中OCT4和SOX2蛋白水平的影响。(2)使用金属离子螯合剂乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)破坏hESC-hESC细胞间连接,然后利用Western blotting检测EGTA单独处理或联合COL4处理对hESC中OCT4与SOX2的蛋白水平的影响。(3)通过基于质谱的定量蛋白质组学技术,检测COL4单独处理或与EGTA联合处理hESC细胞样本中差异表达的磷酸化蛋白和总蛋白,并进行功能富集分析。(4)利用Western blotting和免疫荧光染色检测蛋白酶体抑制剂bortezomib或溶酶体抑制剂氯喹预处理对COL4引起的hESC中OCT4与SOX2蛋白水平下调的影响。(5)利用Western blotting检测COL4对丝切蛋白(cofilin)的影响,以及Rac1小分子抑制剂EHT1864和EHop-016对SOX2蛋白表达水平的影响。结果·(1)COL4和Dispase引起OCT4和SOX2的蛋白水平下降;Accutase、胰酶和机械刮取法未观察到此作用。(2)EGTA处理能够抑制COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降。(3)蛋白质谱和功能富集分析发现,COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降可能与肌动蛋白微丝(actin filament,F-actin)、微管和溶酶体相关蛋白的变化有关。(4)氯喹能够抑制COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降,bortezomib则不能。(5)COL4处理或Rac1抑制剂均能下调cofilin和SOX2的蛋白水平。结论·当使用酶消化细胞团块法处理hESC时,OCT4和SOX2蛋白水平下降,Rac1/cofilin/F-actin信号通路和溶酶体可能参与其中。

• 单位
  上海交通大学; 基础医学院